Bei den meisten Biopharmazeutika handelt es sich um Proteine oder Proteinderivate. Die größte Klasse bei auf dem Markt bzw. in Entwicklung befindlichen Biopharmazeutika ist die der monoklonalen Antikörper (mAbs). Aufgrund ihrer spezifischen Bindungseigenschaften können Antikörper von der biopharmazeutischen Industrie genutzt werden, um die Aktivität pharmazeutisch relevanter Zielmoleküle zu modulieren und so Krankheiten zu behandeln oder zu verhindern.
Ein wesentlicher Unterschied zwischen herkömmlichen kleinmolekularen Pharmazeutika und Biopharmazeutika ist, dass Letztere in flüssiger Form verarbeitet und verabreicht werden müssen. Proteine in Lösung sind jedoch bekanntermaßen instabil. Daher müssen Konzepte entwickelt werden, nach denen diese biotherapeutischen Moleküle hergestellt und langfristig in Lösung gelagert werden können, ohne dass eine Degradation eintritt. Zu diesem Zweck haben sich Proteinstabilitätsassays in der Entwicklung und Herstellung von Biotherapeutika als unverzichtbar erwiesen.
Um die Lebensdauer oder Haltbarkeit eines Proteins in Lösung zu beurteilen, werden eigentlich Echtzeit-Stabilitätsassays benötigt. Diese sind jedoch meist zeitaufwendig. Daher wurden schnellere, prädiktive Verfahren entwickelt. Sie liefern in kurzer Zeit aufschlussreiche Einblicke, anhand derer stabile Formulierungen biologischer Wirkstoffe und Prozessbedingungen entwickelt werden können.
Die meisten dieser prädiktiven Verfahren untersuchen die thermische Entfaltung und damit die physikalischen Eigenschaften eines Proteins als Funktion der Temperatur. Anhand der entsprechenden Daten können die Temperaturen, bei denen ein Protein Konformationsveränderungen erfährt, bestimmt und für Vergleichsstudien herangezogen werden. Es wird davon ausgegangen, dass Moleküle, bei denen Konformationsveränderungen erst bei höheren Temperaturen induziert werden, eine längere Haltbarkeit aufweisen bzw. stabiler sind. Dabei gelten jedoch einige wichtige Ausnahmen, auf die in diesem Dokument später noch eingegangen wird.
Entfaltungs- bzw. Thermostabilitätsprofile können für verschiedene Wirkstoffkandidaten im gleichen Puffer erstellt werden, um die intrinsische Stabilität potenzieller Biotherapeutika unter vorgegebenen Bedingungen zu vergleichen. Dieser Vorgang wird „Kandidatenauswahl“ genannt.
Die Thermostabilitätsprofile können für jedes Kandidatenmolekül in verschiedenen Puffern und Kosoluten erstellt werden, um die stabilisierenden bzw. destabilisierenden Bedingungen identifizieren zu können. Zu den typischen Formulierungsadditiven oder -hilfsstoffen gehören Aminosäuren, Zucker, Polyole, Salze und Netzmittel. Dabei muss sorgfältig darauf geachtet werden, dass diese Substanzen den Assay nicht stören. Prüfungen dieser Art werden typischerweise von Teams der (Prä-)Formulierungs- und Verfahrensentwicklung durchgeführt. Diese Teams versuchen, Aufreinigungsstrategien zu entwickeln, welche die Ausbeute des Biotherapeutikums maximieren. Hierzu müssen sie für die chromatographischen Verfahren und für die Optimierung der Virusinaktivierungsschritte stabile Beladungs- und Elutionspuffer identifizieren.
Die eher quantitativ orientierten Analyseverfahren, wie z. B. die dynamische Differenzkalorimetrie (DSC), werden auch für Biosimilaritäts- und Komparabilitätsstudien eingesetzt.
Wie bereits erwähnt, wird davon ausgegangen, dass Moleküle, bei denen Konformationsveränderungen erst bei höheren Temperaturen induziert werden, eine längere Haltbarkeit aufweisen. Diese „Faustregel“ kann jedoch irreführend sein, wenn das zur Überwachung dieser Veränderungen gewählte Verfahren gegenüber bestimmten konformationellen Ereignissen oder chemischen Inaktivierungsprozessen „blind“ ist. Dies ist einer der Gründe, warum die Beschaffung Ihrer nächsten Plattform für Proteinstabilitätsassays sorgfältiger Überlegungen bedarf.
Zur Messung der Proteinstabilität wird eine Vielzahl von Verfahren angeboten. Um die Qualität der Daten zu dokumentieren, die die entsprechenden Geräte generieren, vergleichen viele Hersteller die Ergebnisse mit denen der dynamischen Differenzkalorimetrie (DSC). Die DSC ist der Standard, an dem sie ihre Verfahren messen. Dies zeigt den hohen Stellenwert, der DSC-Daten in der biophysikalischen Forschung beigemessen wird. Die DSC wird daher häufig als „Goldstandard“ bezeichnet.
Ein Zitat von einem unserer Kunden hebt den Nutzen der DSC hervor:
„Die DSC ist vermutlich das stärkste, aussagekräftigste und wichtigste aller derzeit verfügbaren biophysikalischen Verfahren.“
Sorina Morar-Mitrica, Ph.D., GlaxoSmithKline; The BioProcessing Summit, 2012
Selbstverständlich gibt es auch Beispiele, in denen diese alternativen Verfahren brauchbare Daten generieren. Doch gibt es andererseits viele Fälle, in denen sie sich als weniger geeignet erwiesen haben. Aus naheliegenden Gründen werden diese Fälle nur selten veröffentlicht.
Jeder Lieferant verwendet seine eigene Terminologie und präsentiert seine Geräte und deren Spezifikationen auf eigene Weise. Bevor Sie sich jedoch über die Geräte Gedanken machen, mit denen Sie die Stabilität Ihres Proteins messen können, müssen Sie Ihre spezifischen Anwendungsanforderungen kennen und wissen, wie diese durch Produktmerkmale und -spezifikationen beeinflusst werden.
Die meisten Anbieter von nichtkalorimetrischen Verfahren zur Messung der Proteinstabilität vergleichen ihre Produkte direkt mit der DSC. Von diesen Produkten haben zwar einige den spezifischen Vorteil eines geringeren Probenverbrauchs pro Durchlauf. Dieser geht jedoch zulasten des Informationsgehalts und der Reproduzierbarkeit. Es ist kein Vorteil, Probenmaterial einzusparen, wenn die generierten Daten irreführend sein und zu Fehlentscheidungen führen können. Falls wegen ungenauer Daten zur Proteinstabilität große Teile des Entwicklungsprojekts wiederholt werden müssen, ist dies mit erheblichen Kosten verbunden.
1.Benötige ich das Gerät, um die Stabilität aller Proteine oder biotherapeutischen Kandidaten zu beurteilen?
Die DSC kann für die Analyse aller Proteine eingesetzt werden, unabhängig von der Anzahl oder Position etwaiger Tryptophanreste.
Andere Verfahren, die die intrinsische Fluoreszenz messen, sind nur indirekte Assays für die Proteinstabilität. Was sie tatsächlich messen, ist die Veränderung der Polarität der Umgebung eines Tryptophanrests bei der Entfaltung des Proteins.
Dieses Messprinzip bringt eine Reihe von Problemen mit sich. Die Veränderung der Umgebung dieses spezifischen Aminosäurerests muss für die Entfaltung des gesamten Moleküls repräsentativ sein. Das heißt, dass der Tryptophanrest im Kern des Proteins verborgen und auch in allen Domänen eines Multidomänenproteins vorhanden sein muss. Dies ist in der Realität allerdings eher unwahrscheinlich. Die strukturelle Stabilität einer Subdomäne, die keinen Tryptophanrest enthält, wird nicht bewertet. Dies kann zu einer fehlerhaften Formulierungs- oder Kandidatenauswahl führen, die sich dann auf die nächste Stufe der Entwicklungspipeline auswirken wird. Manche Proteine enthalten gar keine Tryptophanreste und können daher mit Fluoreszenzverfahren (intrinsische Fluoreszenz) auch nicht analysiert werden.
Abbildung 1: DSC-Thermogramme eines biologischen Kandidaten. Diese Daten zeigen die thermische Entfaltung eines Antikörpers in unterschiedlichen Puffern. Die Profile weisen deutliche Schultern auf. Diese repräsentieren die Entfaltung der CH2-, CH3- und Fab-Bereiche des Antikörpers. Aufgrund des höheren TM-Werts und des niedrigeren T1/2-Werts wurden die dem unteren Diagramm entsprechenden Formulierungsbedingungen für die Verwendung ausgewählt.
2.Möchte ich die Stabilität aller einzelnen Domänen eines Multidomänenproteins charakterisieren können?
Aufgrund der hohen Reproduzierbarkeit der DSC und ihrer Fähigkeit, strukturelle Veränderungen des gesamten Proteins zu überwachen, kann sie für eindeutige Messungen der Stabilität einzelner Subdomänen eingesetzt werden. Auch in den von spektroskopischen Verfahren generierten Proteinstabilitätsprofilen können Informationen über Subdomänen enthalten sein. Doch es gibt auch viele Fälle, in denen sie diese Daten nicht liefern können und gegenüber bestimmten strukturellen Veränderungen blind sind. Das liegt daran, dass Tryptophanreste nicht in einer Weise im Protein verteilt sind, wie es für die Fluoreszenzdetektion ideal wäre: Manche Domänen enthalten verborgene Tryptophanreste, andere hingegen nicht. Kritisch kann dies insbesondere dann werden, wenn ein Gerät für den ersten Übergang blind ist. Denn damit sind im Protein strukturelle Veränderungen aufgetreten, die für das zu deren Messung eingesetzte Verfahren unsichtbar bleiben, mit der Folge einer fehlerhaften Auswahl hinsichtlich des Kandidaten oder Formulierungspuffers. Die DSC ist ein generisches, globales und hochauflösendes Verfahren zur Messung der Proteinstabilität, das keines dieser Nachteile besitzt.
Abbildung 2: Die thermische Entfaltung eines Antikörpers, gemessen mittels intrinsischer Fluoreszenzdetektion. Das Profil weist keinen scharfen Übergang auf und ist daher zur Bestimmung des TM-Werts nicht optimal.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung der DSC zur Überwachung der Subdomänenstabilität von Antikörpern ist, dass die Fab-Domäne in der Regel größer ist als die CH2- und CH3-Domäne, wodurch sie einfacher zu identifizieren ist. Bei den meisten spektroskopischen Verfahren ist die Amplitude des Signals nicht domänenspezifisch. Daher ist es keineswegs trivial, zu interpretieren, welche Domäne stabilisiert bzw. destabilisiert wird. Dies ist besonders wichtig für Protein-Engineering-Projekte und bei der Kandidatenauswahl. Hier ist es entscheidend zu verstehen, welcher Teil des Biologikums betroffen ist.
3.Möchte ich, dass meine Daten frei von experimentellen Artefakten sind, die meine Ergebnisse beeinträchtigen könnten?
Viele Verfahren mit geringem Probenverbrauch basieren auf Fluoreszenzanalysen zur indirekten Messung der Proteinstabilität. Zusätzlich zu den bereits beschriebenen Problemen werden Fluoreszenzverfahren durch bestimmte Artefakte beeinträchtigt, die sich meist in Abhängigkeit von der Probenkonzentration verändern. Hierzu gehören insbesondere Fluoreszenzlöschung, innere Filterung, Aggregation und Lichtstreuung. Dies hat zwei wichtige Konsequenzen. Erstens ist es sehr schwierig, reproduzierbare Daten zu erhalten, wenn Daten von verschiedenen Tagen und unterschiedlichen Labors verglichen werden sollen. Es ist nämlich schwierig und zeitaufwendig, sicherzustellen, dass alle Kosoluten in identischen Konzentrationen vorliegen. Zweitens können sich diese Artefakte auf die Form der Entfaltungskurven auswirken. Dadurch liefert die Analyse bei jedem Durchlauf andere Ergebnisse, wird äußerst subjektiv und erfordert für die richtige Interpretation viel Know-how.
Bei manchen spektroskopischen Proteinstabilitätsassays werden Farbstoffe verwendet, um die Proteinstabilität zu untersuchen. Diese Assays haben dieselben Nachteile wie die intrinsische Fluoreszenz. Darüber hinaus kann jedoch der Farbstoff die Stabilität des Proteins beeinträchtigen, oder eine Pufferkomponente kann sich auf das Ausmaß der Wechselwirkung des Farbstoffs mit dem Protein auswirken. Hieraus können sich Stabilitätsprofile ergeben, die die Wechselwirkung des Farbstoffs mit dem Protein widerspiegeln. Dies wird weiter kompliziert durch Störungen durch Pufferkomponenten, sodass die Ergebnisse mit der eigentlichen Proteinstabilität wenig zu tun haben. Gleiches trifft auch für Anwendungen zu, bei denen Stabilitätsprofile als indirekte Methode für das Screening von kleinen Molekülen dienen, die an potenzielle Wirkstoffziele binden.
Da es sich bei der DSC um ein Primärmessverfahren handelt, das die Stabilität des gesamten Proteins misst, d. h. um ein echtes globales Verfahren, ist es von den oben beschriebenen Einschränkungen nicht betroffen.
4.Benötige ich reproduzierbare Daten?
Die DSC wird häufig als „Goldstandard“ der Proteinstabilitätsassays bezeichnet, da sie Daten mit hoher Reproduzierbarkeit liefert. Aus diesem Grund wird die DSC auch für Biosimilaritäts- und Biokomparabilitätsstudien eingesetzt. Die DSC war ein Schlüsselverfahren bei dem kürzlich erfolgreichen Zulassungsantrag für das biotherapeutische Arzneimittel Remsima, einem Biosimilar von Remicade. Ein weiteres Beispiel liefert die Arbeit einer Forschungsgruppe, damals bei Amgen. Diese befand die DSC als das beste Verfahren zur Identifizierung eines biotherapeutischen Produkts, das eine Oxidation erfahren hatte. Der Grund für den Erfolg in dieser Anwendung war die hohe Reproduzierbarkeit der DSC-Daten sowie die Tatsache, dass die DSC selbst geringste Veränderungen der höheren Ordnungsstruktur eines Multidomänenproteins detektieren kann.
Die DSC wird auch auf ihre Einsatzmöglichkeit als diagnostisches Hilfsmittel zur Identifizierung von Patienten mit Krebserkrankungen untersucht. Entscheidend für diese Anwendung ist sicherlich die Reproduzierbarkeit der DSC. Nachfolgend sei der Forschungsleiter des Teams zitiert, das diese Arbeit durchführte. Er hebt die hohe Reproduzierbarkeit der DSC-Daten hervor, die er mit dem Malvern MicroCal VP-Capillary DSC erzielt hat:
„Besonders geeignet für die unbeaufsichtigte Analyse großer Probenanzahlen und zur Minimierung menschlicher bzw. unbeabsichtigter Fehler.“
„Zeichnet sich aus durch eine bemerkenswerte Reproduzierbarkeit der Durchläufe und eine beeindruckende Empfindlichkeit mit der Folge eines geringeren Probenverbrauchs.“
„Mit der Steuerungssoftware einfach zu programmieren.“
„Einfache Wartung und Instandhaltung durch Programmierung regelmäßiger Reinigungs- und Kontrolldurchläufe.“
Adrian Velazquez-Campoy, Institute of Complex Systems Biocomputing and Physics (BIFI), Universität Saragossa, Spanien
5.Möchte ich die Stabilität meines Biologikums in einem breiten Spektrum von Puffern oder Kosoluten messen?
Manche Verfahren weisen sehr spezifische Anforderungen hinsichtlich kompatibler Puffer und/oder Kosoluten auf. Die CD-Spektroskopie liefert ein gutes Beispiel für solche Einschränkungen: Bestimmte Puffer, wie sie auch in Formulierungsstudien verwendet werden, absorbieren nämlich Licht bei derselben Wellenlänge wie das Protein, wodurch eine Sättigung des Signals bewirkt wird. Darüber hinaus ist die Verwendung selbst geringster Mengen von Netzmitteln – eines häufigen Bestandteils von Formulierungspuffern – mit den meisten fluoreszenzbasierten Verfahren nicht kompatibel.
Die DSC ist ein nichtspektroskopisches Verfahren und von dieser Problematik nicht betroffen.
6.Muss ich Proteine mit hoher thermischer Stabilität charakterisieren?
Die DSC ist speziell dafür ausgelegt, die Thermostabilität von Proteinen in einem breiten Spektrum zu messen und bei Subumgebungstemperaturen und hohen Temperaturen gleichermaßen einsatzfähig zu sein. Demgegenüber können spektroskopische Verfahren typischerweise nicht unterhalb von 20 °C oder oberhalb von 90 °C eingesetzt werden. Der Beginn der thermischen Denaturierung thermolabiler Proteine liegt häufig unterhalb der Umgebungstemperatur und kann mit spektroskopischen Verfahren leicht unerkannt bleiben. Am anderen Ende des Spektrums wird – wenngleich viele Proteine einen TM-Wert (die Mittelpunkttemperatur des thermischen Übergangs) unterhalb von 90 °C aufweisen – in der Regel eine um 20 °C höhere Temperatur benötigt, um den Endpunkt genau bestimmen zu können.
Das bedeutet, dass der Einsatz der DSC unumgänglich ist, wenn die TM-Werte Ihrer Proteine bei 70 °C oder darüber liegen.
7.Benötige ich einfach zu analysierende Daten?
Das Malvern MicroCal VP-Capillary DSC verfügt über eine automatische Analysesoftware. Diese gewährleistet objektivere Analysen und setzt weniger spezifisches Know-how voraus. Bei vielen konkurrierenden Verfahren können die Ergebnisse sehr subjektiv und schwierig zu analysieren sein. Dies zeigt sich besonders deutlich bei der Analyse von Multidomänenproteinen, wie z. B. von Antikörpern.
„Der hohe Durchsatz wird von der Analysesoftware unterstützt. Die Software ist leicht zu bedienen, eliminiert manuelle Berechnungen und spart uns so wertvolle Zeit. Durch diese Zeiteinsparungen hat sich unser Workflow deutlich verbessert.“
Katherine Bowers, Fujifilm Diosynth Biotechnologies
8.Möchte ich kleinste Veränderungen der Stabilität meines Proteins erkennen können?
Die DSC kann Veränderungen auf allen Ebenen der Proteinstruktur (Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur) detektieren UND ist äußerst reproduzierbar. Daher kann die DSC selbst sehr kleine Veränderungen der TM-Werte und damit der höheren Ordnungsstruktur (HOS) erkennen.
Beispielhaft dafür wird in einem kürzlich veröffentlichten Artikel bestätigt, dass das DSC-Thermogramm eines Multidomänenproteins gegenüber vielen spektroskopischen Verfahren das beste Mittel war, um unerwünschte, niedrige Konzentrationen (< 5 %) des oxidierten biotherapeutischen Produkts nachzuweisen. (Arthur et al, (2015). J Pharm Sci, Vol 104, 1548–1554)
9.Wie gut ist der Hersteller oder Lieferant?
Achten Sie darauf, die Reputation des infrage kommenden Herstellers oder Lieferanten zu beurteilen, um sicherzustellen, dass Sie in Qualität investieren.
DSC-Geräte müssen von soliden, technologisch führenden Unternehmen entwickelt und nach hohen Qualitätsstandards hergestellt werden, um publikations- und entscheidungsfähige Ergebnisse zu liefern.
Wählen Sie einen Hersteller aus, der eine führende Rolle in der Entwicklung und Optimierung der entsprechenden Technologien belegen kann. Diese Unternehmen fertigen Geräte mit geringen Fertigungstoleranzen und gehören in der Regel zu den Ersten, die Innovationen der Technologie und ihrer Anwendungen entwickeln. Sie verfügen mit höherer Wahrscheinlichkeit über das Know-how, die Erfahrung und die Support-Ressourcen, um nicht nur ausgezeichnete Geräte zu bauen, sondern für diese auch eine adäquate Unterstützung bereitstellen zu können.
10.Wie sieht es mit dem Kundendienst und Support aus?
Wenn Sie ein Gerät kaufen, ist dies erst der Beginn einer langfristigen Beziehung zum Lieferanten oder Hersteller. Es ist daher wichtig, ein System von einem Unternehmen zu kaufen, das einen brauchbaren Kundendienst und Support bietet.
Wählen Sie ein Unternehmen, das mit Support per Telefon, vor Ort und per E-Mail, Weiterbildungsangeboten, Außendienstservice und Expertenunterstützung aufwarten kann. Erkundigen Sie sich vor dem Kauf eines Geräts nach dem angebotenen Support. Sie sollten genau wissen, welchen Support Sie hinsichtlich Qualität und Umfang erwarten können, wenn Sie das neue Gerät in Ihrem Labor installiert haben.
Anwendung/Anforderung | MicroCal DSC | CD-Spektroskopie | IntrinsischeFluoreszenz | ExtrinsischeFluoreszenz |
Generisch für alle Proteine | Ja | Ja | Nein | Nein |
Empfindlich für alle Ebenen der Proteinstruktur | Ja | Nein | Nein | Nein |
Quantitatives Ergebnis direkt proportional zur Menge des gefalteten Materials | Ja | Ja | Nein | Nein |
Globaler, hochauflösender Proteinstabilitätsassay | Ja | Nein | Nein | Nein |
Mehrere Messgrößen für die Proteinstabilität | Ja | Nein | Nein | Nein |
Fingerprint-Eigenschaft des Entfaltungsprofils | Ja | Nein | Nein | Nein |
Frei von optischen Artefakten | Ja | Nein | Nein | Nein |
Hochgradig reproduzierbar | Ja | Nein | Nein | Nein |
Benötigt keine Farbstoffe, Markierungen oder chemischen Additive | Ja | Ja | Ja | Nein |
Frei von Störungen durch Puffer und Kosolute | Ja | Nein | Nein | Nein |
Messung von TM-Werten über 70 °C | Ja | Nein | Nein | Nein |
TM-Messungen nach „Goldstandard“ | Ja | Nein | Nein | Nein |
Die obige Tabelle veranschaulicht deutlich, warum die DSC in der biopharmazeutischen Industrie breite Anwendung findet und als „Goldstandard“ für die Messung der Proteinstabilität betrachtet wird. Gestützt wird diese Einschätzung durch einen kürzlich veröffentlichten Artikel, der die Umfrageantworten von Branchenexperten wiedergibt. Letztere sollten Verfahren für wichtige Anwendungen in der biopharmazeutischen Entwicklungspipeline nach ihrem Nutzen klassifizieren. (Gabrielson, Weiss IV. Journal of Pharmaceutical Sciences 2015; 104:1240–1245) Die Anwendungen reichten von der Kandidatenauswahl und Formulierungsentwicklung bis zu Vergleichbarkeits- und Biosimilaritätsstudien.
Es ist offenkundig, dass die DSC das vielseitigste und am besten geeignete Verfahren zur Beurteilung der Stabilität von Biologika ist.
Einige spektroskopische Verfahren weisen zwar einen geringeren Probenverbrauch als die DSC auf, doch aufgrund inhärenter Schwächen sind sie für diese Anwendung oft schlichtweg ungeeignet. Zu diesen Schwächen gehören Farbstoffinterferenzen, Streuung, innere Filterung, Signalabschwächung/-verlust und unzulänglich definierte Subdomänen-Strukturinformationen.
Viele dieser Mängel und Inkompatibilitäten können sehr kostspielige, suboptimale Entscheidungen zur Folge haben und auf Projektnachbesserungen oder Fehleinschätzungen der Entwicklungsfähigkeit eines biologischen Wirkstoffs hinauslaufen.
Das Malvern MicroCal DSC liefert qualitativ hochwertige, reproduzierbare und artefaktfreie Stabilitätsdaten für jedes Protein in jedem Puffer.
