Sind die Daten verlässlich? Werden sie u. U. durch die Messtechnik, durch den Anwender bei der Probenvorbereitung oder durch die verwendeten Analyseparameter beeinflusst? Zur Validierung der Messwerte sollten unabhängige und orthogonale Messmethoden verwendet werden. Zwei solche komplementäre Verfahren sind die Nanopartikel-Tracking-Analyse und die dynamische Lichtstreuung. Im Folgenden werden wir beide Verfahren und die von ihnen gelieferten komplementären Daten beschreiben. Zudem werden wir erörtern, wie diese Verfahren bei kombinierter Anwendung dank ihrer einzigartigen Fähigkeiten eine umfassende Reihe von Messparametern bereitstellen, die für die Charakterisierung von nanoskaligen Materialien verfügbar sind.
Sind die Daten verlässlich? Mit diesem Problem müssen sich viele Forscher auseinandersetzen, die Partikelmessgeräte einsetzen. Werden die Daten u. U. durch die Messtechnik bzw. durch den Anwender bei der Probenvorbereitung oder durch die verwendeten Analyseparameter beeinflusst? Um diese Frage beantworten zu können, müssen unabhängige und orthogonale Messverfahren herangezogen werden, um die Messwerte zu validieren und Vertrauen zu schaffen.
Zwei solche komplementäre Verfahren sind die Nanopartikel-Tracking-Analyse und die dynamische Lichtstreuung. In diesem White Paper werden beide Verfahren und die von ihnen gelieferten komplementären Daten beschrieben. Zudem wird erörtert, wie diese Verfahren bei kombinierter Anwendung dank ihrer einzigartigen Möglichkeiten eine der umfassendsten Reihen an Messparametern bereitstellen, die für die Charakterisierung von nanoskaligen Materialien verfügbar sind.
Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) ist ein hochauflösendes Einzelpartikelverfahren, bei dem das von Nanopartikeln in Flüssigsuspensionen gestreute Licht visualisiert wird. Es handelt sich um ein dreistufiges Verfahren, bei dem zunächst ein Video der Partikel aufgenommen wird, anschließend deren Bewegungen nachverfolgt werden und schließlich diese Daten analysiert werden, um ein Größenverteilungsprofil zu erstellen:
Abbildung 1: Dreistufiges Verfahren der NTA-Messungen
Durch Verfolgung der brownschen Bewegung jedes einzelnen Partikels und die anschließende Anwendung der Stokes-Einstein-Gleichung kann die Partikelgröße partikelspezifisch berechnet werden.
Hauptmerkmale der NTA-Technologie:
Die dynamische Lichtstreuung (DLS) wird zur Messung von Partikel- und Molekülgröße verwendet. DLS ist ein Kollektiv-Verfahren, das wie die NTA, die Partikelgröße mit der brownschen Diffusion der Partikel in Beziehung setzt. Da beide Verfahren auf demselben Grundprinzip basieren (der Messung der brownschen Bewegung), stellen sie ideale Methoden für orthogonale Messungen dar. Beide Technologien bieten jeweils spezifische Messparameter und haben anwendungsspezifische Vorteile. In Kombination stellen sie ein umfassendes und leistungsstarkes Messinstrumentarium dar.
Hauptmerkmale der DLS-Technologie:
Eine gängige Herausforderung bei der Partikelcharakterisierung ist die Messung von polydispersen Proben. Die Heterogenität von Proben hinsichtlich unterschiedlicher Materialien und Partikelgrößen sowie Unterschiede in den relativen Konzentrationen stellen bei der Charakterisierung eine Herausforderung dar. Allerdings können die komplementären Vorteile von NTA und DLS darüber Aufschluss geben, indem beide Verfahren in Kombination eingesetzt werden.
Bei der Charakterisierung von Proben, die Partikel in einem breiten Größenbereich enthalten, sind zwei häufige Probleme zu beobachten.
Das erste Problem tritt auf, wenn der Anwender eine Probe messen möchte, die eine Population kleiner Partikel enthält, er die Probe jedoch auch auf das Vorhandensein einiger größerer oder übergroßer Partikel untersuchen möchte. Bei vielen dieser Anwendungen repräsentieren die kleineren Partikel den funktionellen Aspekt des Produkts oder der Probe, während die großen Partikel den unerwünschten oder abträglichen Aspekt der Probe repräsentieren. Diese Zusammensetzung liegt bei zahlreichen Anwendungen vor, beispielsweise bei Tinten für Tintenstrahldrucker, deren Druckerdüsen durch Aggregate verstopfen können, bei therapeutischen Proteinen, bei denen Aggregate beim Patienten unerwünschte Immunreaktionen auslösen können, oder beim chemisch-mechanische Polieren (CMP) in der Halbleiterwafer-Herstellung, bei dem große Partikel im Poliermittel den Wafer zerkratzen können. Bei all diesen Beispielen enthält die Probe eine hohe Konzentration kleiner Partikel und eine niedrige Konzentration größerer oder übergroßer Partikel.
In solchen Fällen stellt der Zetasizer Nano eine ideale Lösung dar. Meist kann die Probe unverdünnt gemessen werden, womit eine Probenverwässerung durch das Messverfahren vermieden wird. Abbildung 2 zeigt eine Hämoglobin-Probe in PBS und die Auswirkung der Probenerhitzung auf die Probenaggregation. Abbildung 3 zeigt die zeitabhängige Aggregation der Probe bei zwei unterschiedlichen Temperaturen sowie die Fähigkeit des Zetasizer Nano, die dynamischen Veränderungen der Aggregation im Zeitablauf zu überwachen. Bei diesem Beispiel liefern die Trenderkennungsfunktionen des Zetasizer Nano schnell aussagekräftige und verständliche Daten.
Abbildung 2. DLS-Größenverteilung auf Basis der Intensitätsdaten für Hämoglobin. Die Veränderung der Partikelgröße ist mit der Aufheizung der Probe von 37 °C auf 44 °C assoziiert.
Abbildung 3. DLS-Daten für Hämoglobin. Die Veränderung der Partikelgröße im Zeitverlauf ist mit dem Aufheizen der Probe bei 41 °C und 44 °C dargestellt.
Das zweite häufig auftretende Problem beim Messen einer Probe mit breiter Partikelgrößenverteilung sind exakte Untersuchungen, wie z. B. wie sich Partikel unterschiedlicher Größe auf die Probeneigenschaften auswirken. Eine ideale Lösung in solchen Fällen stellt die hochauflösende Größenbestimmung von Einzelpartikeln mittels NTA dar, um die in der Probe enthaltenen einzelnen Partikelgrößen exakt zu bestimmen.
Um die Auflösung der NTA über ein Spektrum von Partikelgrößen zu demonstrieren, wurde eine Testprobe vorbereitet, die ein Gemisch von Referenzpartikeln mit Durchmessern von 100 nm, 200 nm, 300 nm und 400 nm enthält (siehe Abbildung 4). Durch die Auflösung dieser vier Partikelgrößenpopulationen in einer einzigen Probe kann auch jeder anderen polydispersen Probe zuversichtlich begegnet werden. Die hochauflösende, anzahlbasierte Messung der Partikelgrößenverteilungen ist eine der entscheidenden Stärken des NTA-Verfahrens und ergänzt ideal den breiten Partikelgrößenbereich, der mittels DLS gemessen werden kann.
Abbildung 4. NanoSight NTA-Größenverteilungsdaten für ein Gemisch aus Referenzstandards mit 100 nm, 200 nm, 300 nm und 400 nm bei simultaner Messung zur Demonstration der hochauflösenden Größenbestimmung mit dieser Technologie.
Die Möglichkeit, Proben über einen breiten, dynamischen Konzentrationsbereich hinweg zu messen, ist von entscheidender Bedeutung, da viele Organisationen analytische Messtechniken für unterschiedlichste Aufgaben einsetzen. Bei vielen Anwendungen müssen die Proben in ihrer nativen Form ohne Verdünnung gemessen werden können, da die Verdünnung Probeneigenschaften verändern könnte. Bei vielen DLS-Geräten wird die Rückstreudetektion eingesetzt, um die obere Konzentrationsgrenze zu erweitern. Erfolgt die Messung bei 173°, passiert der Laserstrahl durch die Fokusverschiebung nicht die gesamte Probe. Daher ist die Wahrscheinlichkeit von Mehrfachstreuung herabgesetzt, sodass stärker konzentrierte Proben gemessen werden können. Und weil größere Partikel das Licht stärker unter Vorwärtswinkel streuen, wird durch die Messung bei 173° auch die Wahrscheinlichkeit verringert, dass größere Verunreinigungspartikel die Messung stören.
Der Malvern Panalytical Zetasizer ist das einzige DLS-Gerät, bei dem diese Funktionalität durch die Anwendung der NIBS-Technologie (von engl. Non-Invasive Back Scatter, nichtinvasive Rückstreuung) zusätzlich erweitert wird. Bei der NIBS-Technologie wird – kombiniert mit der Messung bei 173° – eine bewegliche Optik für einen dynamischen Messfokus eingesetzt (siehe schematische Darstellung in Abbildung 5). Hierdurch ist es möglich, die Steulichtweglänge zu ändern, um die Probenanalyse unabhängig von Probenkonzentration und -größe zu optimieren. Um die Leistungsfähigkeit der NIBS-Technologie zu demonstrieren, wurde ein 200 nm Kalibrierstandard über verschiedene Probenkonzentrationen hinweg gemessen. Abbildung 6 zeigt die gemessene Partikelgröße in Abhängigkeit von der Probenverdünnung. Diese Messung zeigt, dass der Zetasizer Nano den Zusammenhang zwischen Partikelgröße und Probenverdünnung über einen Verdünnungsbereich von x3 bis x100.000 als lineares Verhalten darstellen kann. Dies ist von entscheidender Bedeutung für Anwender, die ihre Proben ohne Verdünnung messen möchten, oder für Organisationen, die eine Messfunktionalität über einen besonders großen Konzentrationsbereich für unterschiedlichste Anwendungen benötigen.
Abbildung 5. Schematische Darstellung der DLS-Messposition für (a) schwach streuende oder niedrig konzentrierte Proben und (b) stark streuende oder hoch konzentrierte Proben
Abbildung 6. Diagramm der DLS-Größendaten für 200 nm Polystyrol-Referenzstandards, die mit dem Zetasizer Nano über verschiedene Verdünnungsgrade hinweg gemessen wurden. Die Messung ergibt ein lineares Größenergebnis, unabhängig von der Probenverdünnung.
Im Fluoreszenzmodus können mit den NanoSight-Geräten Partikelgröße, Partikelkonzentration und Zetapotenzial bestimmt werden, wobei nur fluoreszierenden Partikel detektiert und gemessen werden. Das Gerät bietet verschiedene Anregungswellenlängen (405 nm, 488 nm, 532 nm und 642 nm) und somit hohe Flexibilität bei der Auswahl des zu messenden Fluorophors.
Die Messung fluoreszierender Nanopartikel kann für den Anwender aus zweierlei Gründen interessant sein. Erstens ist es eine häufig gestellte Anforderung, die Bestimmung/Auswirkung der Nanopartikel unter biologisch relevanten Bedingungen zu verstehen. Beispielsweise ist es bei der Messung von Drug-Delivery-Vektoren wichtig, die Größe der Vektoren zu kennen, um zu verstehen, an welcher Stelle im Körper diese Partikel angelangen, wie hoch die Zufuhrrate sein kann und wie die Aggregation die biologische Wirkung beeinflusst. In den meisten Fällen wird die Partikelgröße jedoch in vitro gemessen und damit nicht in realer biologischer Umgebung. Mithilfe des Fluoreszenzmessverfahrens können entsprechend markierte Drug-Delivery-Vektoren unter biologisch relevanten Bedingungen gemessen werden. Somit kann z. B. auch der Aggregationsgrad oder Zerstörungsgrad der Vektoren unter biologisch relevanten Bedingungen bestimmt werden. Diese Informationen können die Effizienz eines Delivery-Vektors optimieren. Abbildung 7 zeigt eine Probe aus Liposomen, die mit einem lipophilen fluoreszierenden Farbstoff markiert und anschließend in FCS-Nährmedium suspendiert wurden. Im Lichtstreumodus (Abbildung 7A) werden alle Bestandteile des Mediums visualisiert. Somit ist es nicht möglich, die Liposomen von Interesse spezifisch zu detektieren und zu messen. Abbildung 7B zeigt dieselbe Probe bei gleicher Konzentration, jedoch im Fluoreszenzmodus. In diesem Modus wird von der Kamera nur Fluoreszenzlicht detektiert. Somit werden nur die fluoreszierenden Liposome gemessen. Dies bietet die Möglichkeit, Zielpartikel in komplexen biologischen Medien spezifisch zu messen und damit dem Verständnis der Bestimmung/Auswirkung der Delivery-Vektoren einen wesentlichen Schritt näher zu kommen.
Abbildung 7. NanoSight-Screenshots von fluoreszenzmarkierten, in fetalem Kälberserum suspendierten Liposomen im Lichtstreumodus (A) und im Fluoreszenzmodus (B)
Der zweite Anwendungsbereich, in dem das Fluoreszenzmessverfahren häufig einen Zusatznutzen bietet, ist die Identifizierung spezifischer Partikel in einer unbekannten Probe, wie z. B. bei diagnostischen Anwendungen. Hierbei können fluoreszenzmarkierte Antikörper eingesetzt werden, die sich speziell an Oberflächenantigene von Partikeln binden, welche der Anwender in einer heterogenen Probe identifizieren möchte.
Aggregation kann in kolloidalen Systemen problematisch sein. Das Zetapotenzial eines Systems gibt Aufschluss über die Wahrscheinlichkeit einer Aggregation. Die meisten kolloidalen Dispersionen besitzen eine Oberflächenladung, die auf die Partikeleigenschaften und die Umgebung in der Dispersion zurückzuführen ist. Die Stabilität eines kolloidalen Systems kann durch die Summe der Van-der-Waals-Anziehungskräfte und der Abstoßungskräfte aufgrund der elektrischen Doppelschicht bestimmt werden. Beeinflusst wird das Zetapotenzial durch den pH-Wert, die elektrische Leitfähigkeit und die Konzentration der Formulierungskomponenten. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass Systeme mit einem Zetapotenzial zwischen +30 mV und -30 mV langfristig instabil sind und Aggregation auftritt.
Der Malvern Panalytical Zetasizer Nano misst das Zetapotenzial mittels Laser-Doppler-Elektrophorese. Ein elektrisches Feld wird an eine Moleküllösung oder eine Partikeldispersion angelegt, die sich dann mit einer Geschwindigkeit gemäß ihres Zetapotenzials bewegt. Diese Geschwindigkeit wird mithilfe eines patentierten laserinterferometrischen Verfahrens namens M3-PALS (Phasenanalysen-Lichtstreuung) gemessen. Dies ermöglicht die Berechnung der elektrophoretischen Mobilität. Aus dieser können wiederum das Zetapotenzial und auch die Zetapotenzialverteilung berechnet werden, selbst bei Proben mit sehr geringer Mobilität. Ein Zubehör für die Messung des Oberflächenzetapotenzials nutzt Tracerpartikel zur Messung der Elektroosmose in der Nähe einer Probenoberfläche, um das Zetapotenzial an der Oberfläche berechnen zu können. Das Messgerät kann an einen Autotitrator angeschlossen werden, um Auswirkungen von pH-Wert-Änderungen oder Systemstabilität anhand der Leitfähigkeit zu untersuchen.
Die Fähigkeit des Zetasizer Nano, das Zetapotenzial zu messen, wird ergänzt durch die Fähigkeit der NanoSight Geräte, mittels NTA das Zetapotenzial von Einzelpartikeln zu messen. Durch die Einzelpartikelfunktionalität des letztgenannten Verfahrens können Zetapotenzialverteilungen mit hoher Auflösung gemessen werden. Beim NTA-Verfahren wird das Zetapotenzial aus der Geschwindigkeitsmessung eines suspendierten Partikels bei Anlegen eines elektrischen Felds berechnet (elektrophoretische Geschwindigkeit und Elektroosmose) Beim NanoSight NS500 bspw. wird für jedes nachverfolgte Partikel die Gesamtdriftgeschwindigkeit aufgezeichnet, die sich aus den Komponenten beider Bewegungsarten zusammensetzt. Indem die Gesamtgeschwindigkeit in der geschlossenen Probenkammer in unterschiedlichen Tiefen ermittelt wird, ist es möglich, die beiden Komponenten voneinander zu trennen (unter Annahme einer Nettofließgeschwindigkeit von 0 über die gesamte Tiefe der Kammer). Die elektrophoretische Geschwindigkeit (aufgrund der elektrischen Kraft auf die Partikel) kann daher für jedes vom NS500 nachverfolgte Partikel gemessen werden. Aus dieser kann anschließend das Zetapotenzial auf Einzelpartikelbasis berechnet werden. Das NTA-Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Messung von Zetapotenzial und Partikelgröße und bietet dem Anwender somit eine simultane Multiparametercharakterisierung von Partikeln.
Abbildung 8: Mit dem NanoSight gemessene Einzelpartikel-Zetapotenzialverteilung in Abhängigkeit von der Partikelkonzentration (A) und Partikelgröße in Abhängigkeit vom Partikel-Zetapotenzial (B)
Messung der Partikelkonzentration
Für viele Anwender ist die Partikelgrößenmessung nicht die einzige wichtige Variable, die es zu messen gilt. Für viele Anwendungen ist die Kenntnis über die Partikelkonzentration von entscheidender Bedeutung. Bei Impfstoffen muss der Titer (Konzentration) von Viren oder virusähnlichen Partikeln (von engl. Virus-Like Particles, VLPs) bekannt sein, um die Dosierung eines Impfstoffs bestimmen zu können. Bei Drug-Delivery-Anwendungen kann die Konzentration der Delivery-Vektoren mit der Dosierung des verabreichten Wirkstoffs zusammenhängen. Bei der Anwendung von Exosomen kann die Kenntnis der Konzentration der Vesikel von entscheidender Bedeutung sein, um den Erkrankungsbeginn zu bestimmen, da sich die Konzentration bestimmter Vesikel gegenüber den Kontrollpatientenproben erhöhen kann. Und schließlich werden EU-Verordnungen ausgearbeitet, in denen die Definition und Regulierung von Partikeln festgelegt ist, die als Nanomaterialien bezeichnet werden. Gemäß dieser europäischen Definition ist ein Material aus Partikeln, von denen 50 % in einer Dimension eine Abmessung zwischen 1 und 100 nm aufweisen, ein Nanomaterial. Diese Definition ist zahlenbasiert. Die Möglichkeit, Partikel in diesem Größenbereich zu zählen, wird zunehmend an Bedeutung gewinnen, wenn sich diese Verordnungen fortentwickeln und die als Nanomaterialien klassifizierten Materialien aus Gründen der Sicherheit identifiziert und reguliert werden. In all diesen Fällen ermöglichen es die NTA-Analysegeräte der NanoSight Produktlinie, hochauflösende Partikelgrößenmessungen mit der Partikelkonzentrationsbestimmung zu ergänzen (Partikeln pro Milliliter).
Für den Anwender kann es von Interesse sein, die Auswirkungen auf eine Reihe von Proben bei Veränderung von Probenvariablen und Bedingungen zu ermitteln. Daraus resultiert eine große Anzahl zu messender Proben und ebenso die Anforderung, diese standardisiert und wiederholbar zu messen, um eventuelle minimale Ergebnisunterschiede erkennen und analysieren zu können. Dies stellt eine Herausforderung hinsichtlich des verfügbaren Probenmaterials als auch hinsichtlich der Wiederholbarkeit dar. Um dieses Problem zu vermeiden, wurde der Zetasizer Automatic Plate Sampler (APS) entwickelt. Dieses Gerät kann kleine Probenvolumina in Mikrotiterplatten nach Industriestandard mit 96 oder 384 Kavitäten messen. Es ermöglicht eine erweiterte Lichtstreuungsanalyse jeder einzelnen Probe. Eine schematische Darstellung des Messverfahrens ist in Abbildung 9 gezeigt. Es können SOPs (Standard Operating Procedures) verwendet werden, um die Wiederholbarkeit der Messungen zwischen den Proben sicherzustellen. Die Datenanalyse erfolgt mittels Farbcodierung im Plate Navigator der Software (Abbildung 10). Hier werden spezifische Trends farblich gekennzeichnet, um eine einfache Interpretation der Daten zu erzielen.
Abbildung 9. Schematische Darstellung des Malvern Panalytical Zetasizer APS
Abbildung 10. Die Software Malvern Panalytical Zetasizer APS Plate Navigator ermöglicht eine leistungsstarke und gleichzeitig einfache Datenanalyse. Datentrends können farblich gekennzeichnet werden, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern.
Die dynamische Lichtstreuung des Zetasizer Nano und die Nanopartikel Tracking Analyse des NanoSight ergänzen einander optimal mit ihren umfassenden Messfunktionen zur Charakterisierung von Nanopartikeln und Biopartikeln/Biomolekülen. Beide Geräte messen Partikelgröße und Zetapotenzial. Der breite Partikelgrößenmessbereich des Zetasizer Nano wird durch die hochauflösende Einzelpartikelmessung des NanoSight NTA ergänzt. Die verbreiteten Zetapotenzialmessungen nach Industriestandard mit dem Zetasizer Nano werden durch die hochauflösenden Zetapotenzialmessungen mit dem NanoSight NTA, welches auch eine gleichzeitige Partikelgrößenmessung ermöglicht, ergänzt. Der Zetasizer APS ergänzt diese Messparameter mit der Möglichkeit, Partikelgrößenverteilungen unterschiedlicher Proben via Mikrotiterplatten mit 96 oder 384 Kavitäten automatisiert und standardisiert zu messen. Die in der Zetasizer Nano Produktserie eingesetzte NIBS-Technologie ermöglicht Probenmessungen über einen breiten Konzentrationsbereich hinweg und misst somit Proben auch in nativer, unverdünnter Form. Ergänzend hierzu können die NTA-Systeme der NanoSight Produktserie Partikelkonzentrationen messen, interessant z. B. bei Anwendungen in der Drug-Delivery, Impfstoffentwicklung oder der Exosome/Mikrovesikel. Darüber hinaus können mit den NTA-Geräten der NanoSight Produktlinie Fluoreszenzmessungen durchgeführt werden. Diese ermöglichen dem Anwender, den Verbleib von fluoreszenzmarkierten Partikeln in biologischen Medien zu überwachen oder mittels Antikörpermarkierung Oberflächenmarker auf biologischen Partikeln zu identifizieren.
Diese umfangreichen Messmöglichkeiten ergänzen einander und liefern wertvolle Informationen, sind jedoch auch orthogonal einsetzbar, indem die Datenergebnisse der einen Technologie durch die jeweils andere Technologie validiert und gestützt werden können. Zudem werden die Geräte – wie alle Produkte von Malvern Panalytical – durch ein außergewöhnlich umfangreiches Experten-Team supportet, die Ihnen bei all Ihren Charakterisierungs-Herausforderungen stets zur Seite stehen.
Mehr Informationen finden Sie auf unserer Website www.malvernpanalytical.com oder direkt bei Ihrem Malvern Panalytical Ansprechpartner.
