In diesem technischen Hinweis zeigen wir, wie das WAVEsystem zur genauen Bestimmung der Kinetik in Serum genutzt werden kann. Dank des verstopfungsfreien Mikrofluidikdesigns können kinetische Studien unter Bedingungen durchgeführt werden, die die native Umgebung so genau wie möglich nachahmen, was die Übertragung dieser Ergebnisse in die Klinik ermöglicht.
Die markerfreie Quantifizierung molekularer Wechselwirkungen in komplexen Biofluiden wie Serum liefert wertvolle Informationen für die Durchführung therapeutischer Antikörperstudien. Diese Matrizen setzen jedoch optische Biosensoren oft einer erheblichen Belastung aus, da verschiedene Komponenten zur Verstopfung der Mikrofluidik führen. Dies kann zu längeren Programmverzögerungen führen, weil gegebenenfalls wichtige Wartungsarbeiten durchgeführt werden müssen.
Durch den Einsatz innovativer Einweg-Mikrofluidik ist das Creoptix WAVE hochgradig verstopfungsfest. Dies ermöglicht die kinetische Analyse in physiologisch relevanten Matrizen und liefert im Vergleich zu herkömmlichen Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Technologien bessere Informationen.
Durch die Messung der Wechselwirkung zwischen HER2 und Trastuzumab in Matrizen mit unterschiedlichen Serumkonzentrationen zeigen wir, dass das WAVEsystem mit seiner verstopfungsfreien Mikrofluidik-Technologie eine robuste kinetische Analyse der Antikörperbindung in Biofluiden liefert.
Auf einem 4PCP WAVEchip wurde die HER2-Fc-Fusion (Sino Biological, CN) auf einem Kanal bei 975 pg/mm2 über die Aminkopplung immobilisiert, gefolgt von einer BSA-Passivierung (Roche, CH) auf allen Kanälen, sodass 4200 pg/mm2 des Gesamtproteins pro Kanal erreicht wurden. Für alle Experimente wurde ein Laufpuffer (RB) verwendet (HBS-EP+ mit 0,5 % BSA ergänzt). Trastuzumab (Absolute Antibody, UK) wurde 170 s lang mit 150 ul/min injiziert, gefolgt von einem 300 s langen Dissoziationsschritt. Für den 0-%-Serumzustand wurde Trastuzumab in 100 % RB hergestellt und ausgehend von 20 nM verdünnt (4-fache Verdünnungsreihe).
Für den 50-%-Serumzustand wurde Trastuzumab aus 100 nM in 1:1 (V/V)-Serum:RB hergestellt. Für den 90-%-Serumzustand wurde Trastuzumab aus 100 nM in 9:1 (V/V)-Serum:RB hergestellt. Die Regeneration wurde jedes Mal durch Injektion eines Pulses von 50 mM NaOH, 1 M NaCl erreicht. Die Messungen wurden durch DMSO-Kalibrierung, Doppelreferenzierung und Bulk-Korrektur während der Auswertung angepasst.
| Kinetische Daten | Rmax (pg/mm2) | kon (M-1 .s-1) | koff (s-1) | KD (pM) | |
|---|---|---|---|---|---|
| A | 0-%-Serum | 151.4 | 5.58x105 | 3,19 x 10-5 | 57.1 |
| B | 50-%-Serum | 183.5 | 2.68x105 | 9,1 x 10-6 | 34 |
| C | 90-%-Serum | 100.1 | 2.25x105 | 9,49 x 10-6 | 42.1 |
Tabelle 1: Kinetische Daten für die Wechselwirkung zwischen HER2 und Trastuzumab bei verschiedenen Serumkonzentrationen
![[Abbildung 1 TN201124-Creoptix-affinity-kinetics-antibodies-serum.jpg] Abbildung 1 TN201124-Creoptix-affinity-kinetics-antibodies-serum.jpg](https://p3.aprimocdn.net/malvernpanalytical/2278b103-74a5-45bb-b6f9-ae3f010ff949/Figure%201%20TN201124-Creoptix-affinity-kinetics-antibodies-serum_Original%20file.jpg)
Abbildung 1: Sensorgramme der Wechselwirkung zwischen HER2 und Trastuzumab in verschiedenen Matrizen
