Mit dem neuartigen kinetischen WaveRAPID-Assay die Grenzen der pharmazeutischen Trefferforschung überschreiten

Zusammenfassung

Mit Hochdurchsatz-Screening-Kampagnen für die Arzneimittelforschung mit Tausenden von Verbindungen kann eine große Anzahl von Treffern erzielt werden, die potenzielle Wechselwirkungen mit dem Wirkstoffziel zeigen. Die Bindungsaffinitäten können aus der Steady-State-Analyse vieler Hochdurchsatz-Assays abgeleitet werden. Für die Auswahl der Treffer mit Potenzial für die Weiterentwicklung ist eine vollständige Charakterisierung der Bindungskinetik erforderlich. Auf diese Weise werden Verbindungen identifiziert, die mit günstigen kinetischen Bindungsraten spezifisch zum gewünschten Ziel führen. In der Praxis bedeutet dies, dass umfangreiche kinetische Studien an einer großen Anzahl von Screening-Trefferverbindungen durchgeführt werden müssen. Bis heute ist dies ein äußerst zeit- und materialaufwändiges Unterfangen. Es müssen geeignete Verdünnungsreihen aus Hunderten von Trefferverbindungen hergestellt werden, und jede Konzentration muss in Replikate injiziert werden. Creoptix hat eine neuartige Technologie entwickelt, die derartige Projekte wesentlich effizienter macht und eine robuste kinetische Charakterisierung aus einer Probe mit einer einzigen Konzentration ermöglicht. Creoptix waveRAPID auf dem Creoptix WAVE stellt einen Paradigmenwechsel für kinetische Messungen in einer Screening-Umgebung dar.

In der aktuellen Studie, die von einer HTS-Arzneimittelforschungsgruppe unseres Kunden Idorsia Pharmaceuticals Ltd durchgeführt wurde, zeigen wir die Leistungsfähigkeit des waveRAPID bei der Optimierung der kinetischen Charakterisierung einer großen Anzahl von Wirkstofftrefferverbindungen. In mehreren Experimenten wurde mit dem waveRAPID die Bindungskinetik von bis zu 146 Trefferverbindungen bestimmt, wobei gepulste Injektionen von Proben mit einer einzigen Konzentration für das zuvor auf der Sensormatrix immobilisierte Wirkstoffziel verwendet wurden. Alle analysierten Verbindungen waren zuvor mit modernsten SPR-Instrumenten und herkömmlichen mehrzyklischen Kinetikmessungen untersucht worden. 

Der Vergleich der mit den beiden Technologien gewonnenen Daten ergab eine hervorragende Korrelation für die berechneten Dissoziationskonstanten (K_D) mit nur wenigen stark abweichenden Werten. Dieses Ergebnis zeigt, dass die waveRAPID-Technologie auf dem Creoptix WAVE für die Anwendung in der frühen Wirkstoffforschung geeignet ist und die Generierung von detaillierten kinetischen Daten in Screening-Umgebungen mit hohem Durchsatz ermöglicht. Da die Zeit für die Charakterisierung der einzelnen Verbindungen auf wenige Minuten reduziert wird, können erhebliche Zeit- und Materialeinsparungen erzielt werden. Große Kampagnen zur Bestimmung der Bindungskinetik von Hunderten von Verbindungen können im Vergleich zu aktuellen modernsten SPR-Instrumenten in Tagen statt Wochen durchgeführt werden. 

Darüber hinaus lieferte die waveRAPID-Technologie selbst bei schwierigen Verbindungen (z. B. mit hohem Bulk-Brechungsindex-Beitrag oder mit langsamer Dissoziation) während der gesamten Assay-Reihe zuverlässige Daten. Solche Verbindungen erfordern häufig eine Oberflächenregeneration und eine Neuimmobilisierung des Ligandenproteins. Dadurch wird bei größeren Messkampagnen mit herkömmlichen Mehrzyklus-Assays der Arbeitsablauf unterbrochen. Schließlich ermöglichen das Creoptix WAVE sowie die neuartige waveRAPID-Methode eine äußerst unkomplizierte Assay-Einrichtung und erlauben die vollständige Bindungskinetikanalyse mit einer einzigen Konzentration pro Probe. Darüber hinaus bietet Direct Kinetics, die innovative neuartige Bewertungsfunktion von Creoptix, die auf einer statistischen Parameterschätzung basiert, einen automatisierten und robusten Analyseablauf einschließlich einer realen statistischen Fehlerberechnung. Die waveRAPID-Technologie und die automatisierte Bewertungsfunktion Direct Kinetics stellen ein leistungsstarkes Paket dar, das das Potenzial hat, die Art und Weise zu verändern, wie kinetische Bindungsassays heute in der frühen Wirkstoffforschung durchgeführt werden.

Materialien und Methoden

Creoptix-Protokoll

Histidin-markiertes Zielprotein 1 und Histidin-markiertes Zielprotein 2 wurden auf einem zuvor mit Ni²⁺-Ionen beladenen 4PCP-NTA WAVEchip mit einer Dichte von 4000 bis 5000 pg/mm² erfasst. Gepulste waveRAPID-Injektionen von Verbindungen aus einer 10 μM-Probenlösung wurden 25 Sekunden lang durchgeführt, gefolgt von einer 250 Sekunden langen Pufferinjektion mit einer Durchflussrate von 32,5 μl/min pro Durchflusszelle. Alle Messungen wurden in 50-mM-Phosphatpuffer mit 0,05 % Tween-20 und 5 % DMSO vorgenommen. Die Daten wurden durch Subtraktion des Referenzkanalsignals von Leerinjektionen doppelt referenziert. Die scheinbare Konzentration der Verbindungen im Sensorbereich über die sechs Injektionspulse wurde mit einer gepulsten Injektion von Laufpuffer mit zusätzlich 0,5 % DMSO kalibriert, wobei die gleichen Injektionsparameter wie für die Verbindungsproben verwendet wurden. Die kinetische Analyse wurde mit der Direct Kinetics Schätzfunktion mit einem 1:1-Bindungsmodell durchgeführt.

Biacore-Protokoll

Histidin-markiertes Zielprotein 1 und Histidin-markiertes Zielprotein 2 wurden auf einem zuvor mit Ni²⁺-Ionen aktiviertem Ni-NTA-Chip mit einer Dichte von 4000 bis 5000 pg/mm² erfasst. Die Analyten wurden durch eine serielle Verdünnung in einem Laufpuffer (50 mM Phosphatpuffer mit 0,05 % Tween-20 und 5 % DMSO) auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Die Sensorgramme wurden mit einer Assoziationszeit von 100 s, einer Dissoziationszeit von 250 s und einer Durchflussrate von 40 μl/min aufgenommen. Um die Bindungskinetik (k_on, k_off und K_d) zu bestimmen, wurden die nach der doppelten Referenzierung ermittelten Sensorgramme von der Biacore T200 Evaluierungssoftware mit einem 1:1-Bindungsmodell analysiert.

Ergebnisse

Die neuartige waveRAPID-Technologie zur schnellen Erfassung kinetischer Bindungsdaten in einer Screening-ähnlichen Umgebung wurde in dieser Studie mit modernsten Instrumenten und Methoden validiert. Wie in Abbildung 1 gezeigt, können kinetische Bindungsdaten für eine große Anzahl von Screening-Trefferverbindungen durch gepulste Injektion jeder Probe mit einer einzigen Konzentration schnell erzeugt werden. Einschließlich der Analytdissoziation dauerte jede Messung etwa 5 Minuten. Die vom waveRAPID erzeugten typischen Reaktionsprofile sind in Abbildung 1, Panel A und B, dargestellt (Daten in rot, kinetisches 1:1-Modell in schwarz). Die bewerteten Parameter sind auf einer Ratenkarte im Panel C dargestellt (während des gesamten Assays injizierte Kontrollsubstanz im schwarzen Kreis), die eine hervorragende Reproduzierbarkeit zeigt. Typische Assay-Zeiten und der Probendurchsatz eines beispielhaften Assays mit 384 Proben auf zwei Zielen sind in Tabelle 1 angegeben. 

Abbildung 1: Anwendung von GCI auf dem Creoptix WAVEdelta für die frühe Erforschung und Charakterisierung von Wirkstofftreffern unter Verwendung der neuartigen waveRAPID-Technologie Die vollständige kinetische Charakterisierung kann von Verbindungen abgeleitet werden, die in einer einzigen Konzentration in einer Screening-Umgebung mit waveRAPID injiziert werden, was große Zeit- und Kosteneinsparungen bei der frühen Erforschung von Wirkstofftreffern ermöglicht.
(a) Es wird eine repräsentative Auswahl von waveRAPID-Reaktionsprofilen aus einem Screening von 80 Verbindungen gezeigt.
(b) Mit maßgeschneiderten Injektionseinstellungen aus wählbaren Voreinstellungen in WAVEcontrol kann der gesamte Affinitätenbereich abgedeckt werden. Hier wurden Einstellungen für Zwischenbindemittel verwendet (20 Sekunden gepulste Injektion, 250 Sekunden Dissoziation), die die Bestimmung von Affinitäten von niedrigen nanomolaren bis zu niedrigen mikromolaren Werten ermöglichen.
(c) Auf einer Ratenkarte mit identischen Affinitäten auf den diagonalen Linien werden kinetische Raten gezeigt. Datenpunkte im Kreis zeigen die hervorragende Reproduzierbarkeit der Kontrollverbindung über den gesamten Assay.

Tabelle 1: Beispielhafte Assay-Laufzeiten und Probendurchsatz im Vergleich zwischen waveRAPID auf dem WAVEdelta mit den modernsten Technologien (Biacore T200, 8k) für die vollständige kinetische Charakterisierung von 384 Proben auf 2 Zielen.

Die ermittelten kinetischen Daten wurden nach Fehlern bei den Bindungsraten (unter 100 % des absoluten k_a und unter 50 % des absoluten k_d) gefiltert und mit Daten aus standardmäßigen SPR-Mehrzyklusmessungen verglichen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, zeigt der Vergleich mit herkömmlichen SPR-Mehrzyklusmessungen eine sehr gute Korrelation zwischen den beiden Datensätzen. 

Abbildung 2: Die mit waveRAPID auf dem Creoptix WAVEdelta gemessene Bindungskinetik von Wirkstoff-Screening-Treffern wird mit Werten verglichen, die durch herkömmliche kinetische Mehrzyklusmessungen auf einem Biacore T200-Instrument ermittelt wurden. Die waveRAPID-Daten wurden auf statistische Fehler hinsichtlich der Assoziationsrate (k_a) unter 100 % und der Dissoziationsrate (k_d) unter 50 % des berechneten Ratenparameters gefiltert. Die Korrelation bestätigt die zehnfach schnellere waveRAPID-Kinetikmethode im Vergleich zur herkömmlichen Methode.

Um das System noch weiter zu fordern, wurde eine weitere Messreihe durchgeführt, bei der während des gesamten Assays schwierigere Verbindungen verwendet wurden, die bei den herkömmlichen Mehrzyklusmessungen zu Unterbrechungen des Arbeitsablaufs führen und eine Oberflächenregeneration notwendig machen. Vermutlich aufgrund der deutlich kürzeren Kontaktzeit des Analyten mit dem Zielprotein stören diese schwierigen Moleküle (mit hoher Massenreaktion oder langsamer Dissoziation) den Gesamtarbeitsablauf auf dem WAVE nicht und machen eine intermittierende Oberflächenregeneration unnötig. Wie in Abbildung 3 gezeigt, konnten die kinetischen Bindungsparameter fast aller interessierenden Verbindungen weiterhin robust mit geringen Fehlern bewertet werden. Die Positivkontrolle ergab dennoch eine hohe Reproduzierbarkeit.

Abbildung 3: 30 zuvor charakterisierte Verbindungen wurden erneut in einem Assay gemessen, der ebenfalls 30 anspruchsvollere Verbindungen enthielt, die einen hohen Bulk-Brechungsindex (RI)-Beitrag oder eine langsame Dissoziation zeigten, sowie die anspruchsvolle Verbindung, die während des gesamten Assays injiziert wurde. Während die anspruchsvollen Verbindungen in der herkömmlichen Mehrzykluskinetik erhebliche Einschränkungen des Arbeitsablaufs verursachten, was eine regelmäßige Oberflächenregeneration erforderlich machte, ermöglichte das waveRAPID einen nahtlosen Arbeitsablauf mit kontinuierlicher unbeaufsichtigter Messzeit. Die statistischen Fehler in Prozent der absolut berechneten Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten, die von der Creoptix Direct Kinetics Schätzfunktion ermittelt wurden, werden auf der horizontalen bzw. vertikalen Achse dargestellt. Verbindungen, die bei früheren Assays kein problematisches Verhalten zeigten (grüne Markierungen), sowie Replikate der Kontrollverbindung (violette Markierungen), sind eindeutig durch geringe Fehler identifizierbar. Außerdem können Verbindungen, die bei früheren Assays aufgrund des hohen Bulk-Brechungsindex-Beitrags zu Schwierigkeiten geführt hatten, auf dem WAVE robust und mit geringen Fehlern analysiert werden (blaue Markierungen). Die verbleibenden schwer zu analysierenden Verbindungen sind deutlich durch größere Fehler (rote Markierungen) charakterisiert.

Zusammenfassung

Dank der hohen Empfindlichkeit, der Fähigkeit, extrem schnelle Wechselwirkungen zu bestimmen, und der waveRAPID-Assay-Technologie ermöglicht das WAVEsystem die kinetische Charakterisierung einer großen Anzahl von Wirkstofftrefferverbindungen in wesentlich kürzerer Zeit als herkömmliche kinetische Mehrzyklus-Assays. Durch die Gewinnung von Kinetikdaten aus einer einzigen Quelle mit einer einzigen Injektion wird der Reagenzien- und Probenverbrauch reduziert, was erhebliche Vorteile für die frühe Wirkstoffforschung bedeutet. Darüber hinaus bietet waveRAPID:

• Mit herkömmlicher SPR vergleichbare Ergebnisse in wesentlich kürzerer Zeit
• Kürzere Kontaktzeit, Erhaltung des Zielproteins und längere ununterbrochene Assays
• Hohe Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse
• Bindungskinetik durch eine einzige Injektion zur Auswahl von Treffern anhand relevanter Parameter
• Mehr Wechselwirkungen, die in Tagen statt in Wochen charakterisiert werden können
• Fundierte statistische Fehlerberechnung, um relevante Treffer zu erkennen und problematische Verbindungen herauszufiltern

Wichtige Erkenntnisse

• Kürzere Probenkontaktzeit bewahrt Zielintegrität bei längeren Durchläufen
• Bindungskinetik mit einer einzigen Injektion
• Reproduzierbar und mit herkömmlichen SPR-Technologien vergleichbar

Ideal für:

• Screening von Rohgemischen: kleine Moleküle, Fragmente und Peptide
• Schneller Hit-to-Lead-Fortschritt
• Leitsubstanzoptimierung
• Instabile Ziele
• Schwierige Verbindungen
  

Danksagung

Wir danken Geoffroy Bourquin, Laksmei Goglia, Solange Meyer und Oliver Peter für die Durchführung aller Experimente und ihren Beitrag zu diesem technischen Hinweis.