Das biophysikalische Screening von Substanzbibliotheken zur Identifizierung von Liganden, die mit einem Protein interagieren, ist effizient, gibt aber in der Regel keinen Aufschluss darüber, ob (oder wie) die Liganden die funktionellen Eigenschaften des Proteins beeinträchtigen können. Hierfür ist ein biochemischer/funktioneller Assay erforderlich. Bei Proteinen, deren Funktion von einer Änderung der Konformationsfähigkeit abhängt, sind solche Assays jedoch typischerweise komplex oder weisen einen geringen Durchsatz auf.
Wir haben einen Hochdurchsatz-Biosensor mit Frequenzverdopplung (SHG) untersucht, um Fragmente, die bei der Bindung an ein Protein Konformationsänderungen hervorrufen, in Echtzeit nachzuweisen und dynamische Regionen zu identifizieren. Es wurden SHG-Assays im Multiwell-Plattenformat für den Wildtyp und sechs gentechnisch hergestellte Einzel-Cystein-Mutanten des Acetylcholin-Bindungsproteins (AChBP), eines Homologs der ligandengesteuerten Ionenkanäle (LGICs), entwickelt. Sie wurden über Amin- bzw. Maleimid-Kopplung mit Markern konjugiert, die bei Frequenzverdopplung aktiv sind.
Das biophysikalische Screening von Substanzbibliotheken zur Identifizierung von Liganden, die mit einem Protein interagieren, ist effizient, gibt aber in der Regel keinen Aufschluss darüber, ob (oder wie) die Liganden die funktionellen Eigenschaften des Proteins beeinträchtigen können. Hierfür ist ein biochemischer/funktioneller Assay erforderlich. Bei Proteinen, deren Funktion von einer Änderung der Konformationsfähigkeit abhängt, sind solche Assays jedoch typischerweise komplex oder weisen einen geringen Durchsatz auf.
Wir haben einen Hochdurchsatz-Biosensor mit Frequenzverdopplung (SHG) untersucht, um Fragmente, die bei der Bindung an ein Protein Konformationsänderungen hervorrufen, in Echtzeit nachzuweisen und dynamische Regionen zu identifizieren. Es wurden SHG-Assays im Multiwell-Plattenformat für den Wildtyp und sechs gentechnisch hergestellte Einzel-Cystein-Mutanten des Acetylcholin-Bindungsproteins (AChBP), eines Homologs der ligandengesteuerten Ionenkanäle (LGICs), entwickelt. Sie wurden über Amin- bzw. Maleimid-Kopplung mit Markern konjugiert, die bei Frequenzverdopplung aktiv sind.
Zur Validierung des Assays wurde bestätigt, dass die durch Agonisten und Antagonisten des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR) ausgelösten Konformationsänderungen in AChBP qualitativ unterschiedlich sind. Anschließend wurde eine Bibliothek mit 1056 Fragmenten auf alle Varianten hin untersucht und erfolgreich Konformationsmodulatoren von AChBP identifiziert, wobei die Trefferquote je nach AChBP-Variante zwischen 9 und 22 % lag. Für die orthogonale Validierung und Strukturanalyse wurde eine Teilmenge von vier Treffern ausgewählt. Ein Biosensortest auf der Grundlage der Gitter-gekoppelten Interferometrie mit Zeitauflösung bestätigte, dass es sich bei der Wechselwirkung um eine reversible einstufige 1: 1-Wechselwirkung handelt. Außerdem wurden die Affinitäten und kinetischen Ratenkonstanten der Wechselwirkung geschätzt (KD = 0,28 - 63 μM, ka = 0,1 - 6 μM-1 s-1, kd = 1 s-1). Die Röntgenkristallographie zweier Fragmente bestätigte ihre Bindung an einer zuvor beschriebenen konformationsdynamischen Stelle, die der regulatorischen Stelle von LGICs entspricht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass SHG die Empfindlichkeit besitzt, Fragmente zu identifizieren, die Konformationsänderungen in einem Protein induzieren. Eine Auswahl von Fragmenttreffern mit einem Reaktionsprofil, das sich von dem bekannter LGIC-Regulatoren unterscheidet, wurde charakterisiert, und es wurde bestätigt, dass sie an dynamische Regionen des Proteins binden.
