In dieser Application Note zeigen wir, wie mit Geräten der NanoSight Linie eine Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) durchgeführt wird, um den Zustand von Nanopartikeln zu bestimmen, insbesondere deren Größe, Größenverteilung und Konzentration in Testmedien, bevor nanotoxikologische und ökotoxikologische Untersuchungen folgen.
Die rasche Zunahme der Entwicklung und des Einsatzes technischer Nanopartikel (NP) eilt den Methoden für die Beurteilung und das Management ihrer potenziellen Risiken nach wie vor voraus. Neuartige Eigenschaften, die aus der Partikelgröße im Nanobereich resultieren, bilden die Grundlage für das Leistungsversprechen von Nanomaterialien. Selbst wenn die Toxikologie, des Produktes in grober Form, gut bekannt ist, kann keinesfalls automatisch von einer Analogie der Eigenschaften für dasselbe Material im Nanomaßstab ausgegangen werden. Es handelt sich vielmehr um grundsätzlich neue Materialien. Es wächst das Bewusstsein, dass die längerfristigen potenziellen toxischen Auswirkungen solcher Materialien und deren mögliche Umweltauswirkungen noch nicht ausreichend erforscht sind. Demzufolge gilt den potenziellen toxikologischen Auswirkungen technischer Nanomaterialien ein starkes Interesse und intensive Forschungstätigkeit. Begleitet wird dies von einer Bewertung der Bedeutung der Nanopartikelfraktionen in bestehenden Produkten und Formulierungen.
Vor Beginn einer nanotoxikologischen Untersuchung ist es unerlässlich, den Zustand der verwendeten Nanopartikel zu kennen. Dies betrifft insbesondere deren Größe, Größenverteilung und Konzentration in einem geeigneten Testmedium.
Die Partikelgröße bestimmt die Diffusionsraten, die Durchdringung oder Schutzwirkung von biologischen Barrieren und die Partikelwechselwirkungen.
In dieser Application Note wird die Anwendung der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) zur Charakterisierung von Gold-Nanopartikeln und deren Aggregaten in einer biologisch relevanten Flüssigkeit erörtert. Ergänzend zu den klassischen Lichtstreuungsverfahren ermöglicht die NTA die Größenbestimmung und Zählung von Nanopartikeln in Suspension auf einer partikelspezifischen Basis und damit eine hoch aufgelöste Charakterisierung der Aggregation. Die Studie untersucht die Größenänderung von Gold-Nanopartikeln. Dabei wird die Standarddispergierlösung (Citratpufferlösung) mit einem verdünnten Plasma verglichen (das Proteine enthält) (NIST, 2007).
Von gesunden Spendern wurden Blutproben genommen. Die Probenröhrchen wurden 5 Minuten lang bei einer RZB von 800 zentrifugiert, um die roten und weißen Blutkörperchen abzusetzen. Die überstehende Flüssigkeit (das Plasma) wurde in beschriftete Probenröhrchen umgefüllt und bei -80 °C aufbewahrt. Nach dem Auftauen wurde das Plasma erneut 3 Minuten lang bei einer RZB von 16100 zentrifugiert, um die Restanteile von roten und weißen Blutkörperchen weiter zu verringern. Die überstehende Flüssigkeit wurde in ein neues Gefäß umgefüllt, wobei darauf geachtet wurde, den Bodensatz nicht aufzuschütteln.
Es wurden Gold-Nanopartikel nach NIST-Standard mit einem Durchmesser von 60 nm verwendet (NIST-Referenzmaterial 8013). Diese wurden gemäß den relevanten Untersuchungsberichten gelagert, vorbereitet und verwendet (NIST, 2007). Das Gold wurde unter Verwendung einer Standard-Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,19 auf eine Konzentration von ca. 108 Partikeln/ml verdünnt. Für die Dispersionen in Plasma wurde das Humanplasma im Verhältnis 1:106 mit Citratpufferlösung verdünnt. Anschließend wurden 10 µl der Gold-Nanopartikel mit 790 µl des verdünnten Plasmas verdünnt.
Die Nanopartikel-Tracking-Analyse wurde auf einem NanoSight LM10 durchgeführt. Alle Probenvorbereitungen und Messungen wurden an der University College Dublin in Irland durchgeführt. Es wurden mehrere Videos mit einer Länge von je 166 s aufgezeichnet und im Chargenmodus analysiert, um eine statistische Invarianz zu gewährleisten. Da es sich bei Plasma um ein natürliches ionisches Medium handelt, ist anzumerken, dass das Problem der Proteinaggregation stets vorhanden ist.
Es wurden Videos von den Nanopartikeln aufgezeichnet (Abbildung 1), nachverfolgt und auf Größe und Konzentration analysiert. Dabei wurden Verdünnungen in Citratpufferlösung und Humanplasma untersucht.(Abbildung 2).
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Die Methoden für die Messung von in Citratpufferlösung verdünntem Gold entsprachen denen im Referenzmaterialbericht (NIST, 2007).
Mit der NTA kann sowohl anhand einer visuellen Identifizierung als auch anhand einer Konzentrationsmessung festgestellt werden, dass die Partikel weiterhin monodispergiert sind. Dies stützt die Hypothese, dass Proteine in Suspension die Nanopartikel umhüllen (und dass die Größenzunahme nicht auf Aggregation zurückzuführen ist).
Die in den Abbildungen 1 und 2 verzeichneten Größenänderungen zeigen eine Zunahme der Nanopartikelgröße von ca. 10 nm, entsprechend einer 5 nm dicken adsorbierten Proteinschicht, die die Nanopartikel umhüllt.
In Gegenwart eines biologischen Mediums wie Humanplasma wurde eine signifikante und messbare Änderung der Partikelgrößenverteilung von monodispersen Gold-Nanopartikeln festgestellt. Es wird eine geeignete Methode zur Messung der Dicke der Plasmaschicht mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse beschrieben.
Breite und Mittelwert der Verteilung der in Citrat dispergierten und mittels NTA gemessenen Partikel sind vergleichbar mit den am NIST bestimmten Werten. In Gegenwart von Plasma nehmen sowohl die Partikelgröße als auch die Partikelgrößenverteilung zu.
Die NTA ermöglicht die Messung der absoluten Konzentration, wodurch sie auch zur Bestimmung der Anzahlkonzentration der NIST-Gold-Nanopartikel eingesetzt werden kann. Zudem eignet sich die NTA ideal zur Identifizierung und Zählung von Nanopartikelaggregaten, wie z. B. von Dimeren, die damit leicht unterschieden werden können. Sie stellt somit (für die hier verwendeten Nanopartikel und Konzentrationsregimes) innerhalb des bestehenden Spektrums an Techniken für die Bionanoforschung und die Untersuchung der Bionanointeraktionen von technischen Nanomaterialien in der Biologie ein nützliches Instrument dar.
Die NTA ist als analytische Methode anerkannt, um Informationen über die Größe und – gleichermaßen wichtig – die Konzentration von Nanopartikeln zu gewinnen. Dies gilt selbst für komplexe Probentypen mit hoher Polydispersität (Montes-Burgos et al., 2010; Lynch, 2008; Montes-Burgos et al., 2007). Die NTA gehört zu einer Reihe von Verfahren, mit denen die Umweltauswirkungen und die potenzielle Zytotoxizität von Nanopartikeln in Zukunft untersucht werden könnten (Borm et al., 2006; Tenuta, 2008; Tran, Anton, 2009; Kuhlbusch et al., 2010; Hassellöv, Kaegi, 2009; Stolpe et al., 2011).
Neuere Studien haben gezeigt, dass die Wechselwirkungen zwischen NP und Umweltmatrices extrem komplex sind und hinsichtlich ihrer Quantifizierung und Modellierung eine beträchtliche Herausforderung darstellen. Gerade hier kann die NTA jedoch einen Weg zur Untersuchung und Analyse bereitstellen (Gornati et al., 2009; Hartmann, 2011; Arvidsson et al., 2011; Howard, 2010; Njuguna et al., 2011; Tran et al., 2009).
In einer Studie über die Auswirkungen einer Beschichtung auf nullwertigem Nanoeisen (nZVI) auf die frühe Entwicklung von drei wichtigen marinen Wirbellosen haben Kadar et al. (2012) mittels NTA die Auflösung von nZVI in Meerwasser untersucht und gezeigt, dass die Beschichtung zur Stabilisierung der Nanometallsuspension beitrug. Des Weiteren hat Kadar die Auswirkungen von industriell relevanten und mittels NTA analysierten technischen Eisennanopartikeln auf das Wachstum und den Stoffwechselstatus von marinen Mikroalgenkulturen untersucht. Dabei beschrieb er nachfolgende Veränderungen der Wachstumsrate, Größenverteilung, Lipidprofile und zellulären Ultrastruktur (Kadar et al., 2012).
Poynton et al. (2012) verwendeten ein 15-k-Oligonukleotid-Microarray für Daphnia magna, einen Süßwasserkrebs, der als gängige Indikatorart für Toxizität dient, um zwischen partikelspezifischer Toxizität und der Toxizität von Silberionen zu unterscheiden und Expositionsbiomarker für Citrat beschichtete und PVP-beschichtete Silber-NP zu entwickeln. Dabei bestimmten sie den Grad der Aggregation von Silber-NP mittels NTA, bevor sie deren Toxizität auf dem Genomniveau untersuchten.
Bei einer Untersuchung der Toxizität von Zinkoxid-Nanopartikeln gegenüber Folsomia Candida haben Waalewijn-Kool et al. (2012) gezeigt, dass Unterschiede in den Methoden zur Aufstockung von Expositionsmedien zum Testen von Dispersionsgrößeneigenschaften kaum Änderungen der Reproduktionskapazität des Organismus zur Folge hatten. NTA und TEM zeigten übereinstimmend, dass die Toxizität von Zinkoxid nicht in Zusammenhang mit der Partikelgröße steht.
Auf zellulärer Ebene hat sich die NTA bei der Untersuchung der Genotoxizität von Cobalt-NP in peripheren humanen Leukozyten (Colognato et al., 2008) und Mausfibroblasten (Ponti et al., 2009) als nützlich erwiesen. Die Fähigkeit von Nanopartikeln, die menschliche Plazentaschranke zu durchdringen (Wick et al., 2009), sowie Methoden zur Untersuchung ihrer Wirkungen auf andere biologische Barrieren wurden erforscht (Linn et al., 2010). Hierzu gehört auch der Transport von Siliciumdioxid-Nanopartikeln durch die menschliche Haut (Staroňová et al., 2012). Similarly, Filon et al. (2012) über die Durchdringung der intakten und geschädigten menschlichen Haut durch Cobalt-Nanopartikel. In einem In-vitro-Diffusionssystem konnte Co in Form von Nanopartikeln die menschliche Haut durchdringen.
Ein Verständnis der Größenverteilung von Nanopartikeln ist von entscheidender Bedeutung, bevor sie für zytotoxologische Tests in zelluläre Systeme eingebracht werden. Die NTA hat sich in dieser Hinsicht als nützlich erwiesen (Kendall et al., 2009; Patel et al., 2010; Munaro, 2010; Karlsson, 2010). Die chemischen Interaktionen von Nanopartikeln unterschiedlicher Typen mit diversen Matrices biologischen Ursprungs, wie Serum (Treuel et al., 2010), sowie mit organischen Schadstoffen (Ben-Moshe et al., 2009) und Dithiothreitol (Sauvain et al., 2008) wurden ebenfalls untersucht.
Die toxikologischen Auswirkungen von Cobalt-Nanopartikelaggregaten (Co-NP) wurden untersucht und mit denen von Cobaltionen verglichen. Dabei wurden unterschiedliche Zelllinien verwendet, die Lunge, Leber, Niere, Darm und Immunsystem repräsentierten. Die Gesamtergebnisse waren im Einklang mit der Hypothese, dass die toxischen Wirkungen aggregierter Cobalt-NP hauptsächlich auf das Herauslösen von Cobaltionen aus den aggregierten NP zurückzuführen sind (Limor et al., 2011).
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