A maioria dos produtos bioterapêuticos são proteínas ou derivados de proteínas. A maior classe de produtos biofarmacêuticos atualmente no mercado ou em desenvolvimento é a de anticorpos monoclonais (mAbs). A natureza de ligação específica de anticorpos forneceu ao setor biofarmacêutico a oportunidade de usá-los na adaptação da atividade de moléculas-alvo relevantes do setor farmacêutico para controlar ou impedir doenças.
Uma diferença importante entre os produtos farmacêuticos de moléculas pequenas tradicionais e os produtos biofarmacêuticos é que os biofarmacêuticos precisam ser processados e fornecidos na forma líquida. As proteínas são notoriamente instáveis na solução. Por isso, é necessário desenvolver abordagens através das quais essas moléculas bioterapêuticas possam ser fabricadas e armazenadas por longos períodos de tempo na solução sem degradá-las. Este é o local onde os ensaios de estabilidade de proteínas mostraram-se indispensáveis no desenvolvimento e na fabricação de produtos bioterapêuticos.
Nitidamente, os ensaios de estabilidade em tempo real deverão avaliar a longevidade ou o tempo de prateleira de uma proteína na solução. No entanto, muitas vezes, eles são demorados. Por isso, os métodos preditivos mais rápidos foram estabelecidos para acelerar o processo de aprendizado do qual as formulações de biofármacos estáveis e as condições de processo podem ser desenvolvidas.
Entre essas abordagens preditivas estão os métodos de desdobramento térmico que monitoram as propriedades físicas da proteína como uma função da temperatura. Com esses dados, as temperaturas nas quais uma proteína passa por alterações conformacionais podem ser determinadas e utilizadas para estudos comparativos. Presume-se que as moléculas que requerem temperaturas mais elevadas para induzir alterações conformacionais têm um tempo de prateleira maior ou são mais estáveis. No entanto, existem algumas exceções importantes que serão explicadas mais adiante neste documento.
Os perfis de estabilidade térmica ou de desdobramento podem ser obtidos para diferentes fármacos candidatos no mesmo tampão para comparar a estabilidade intrínseca dos possíveis produtos bioterapêuticos sob condições específicas. Esta aplicação é denominada “seleção de candidatos”.
Os perfis de estabilidade térmica podem ser gerados para qualquer molécula candidata em uma série de tampões e co-solutos para ajudar a identificar condições de estabilização/desestabilização. Os aditivos ou excipientes de formulação típica incluem aminoácidos, açúcares, polióis, sais e detergentes. É preciso ter cuidado para garantir que essas substâncias não interfiram no ensaio. Em geral, esses tipos de testes são executados por pré/formulação ou grupos de desenvolvimento de processos. Esse último objetivo identifica as estratégias de purificação que aumentarão o rendimento do produto bioterapêutico ao identificar o carregamento estável e os tampões de eluição para processos cromatográficos e para a otimização de etapas de inativação viral.
As mais quantitativas dessas tecnologias analíticas, como Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC), também são usadas em estudos de biossimilaridade e comparabilidade.
Como afirmado anteriormente, pressupõe-se que as moléculas que exigem temperaturas mais elevadas para induzir alterações conformacionais terão um tempo de prateleira maior. No entanto, esta “regra geral” pode estar incorreta caso a técnica escolhida para monitorar essas mudanças seja “oculta” para alguns eventos conformacionais ou processos de inativação química. Por esse motivo, é necessário ter cuidado ao comprar sua próxima plataforma de ensaio de estabilidade de proteínas.
Há várias tecnologias no mercado para a medição da estabilidade de proteínas. Muitos fabricantes demonstram a qualidade dos dados que estes instrumentos geram ao comparar os resultados com os obtidos pela Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). DSC é o padrão usado para medir as tecnologias e apresenta o elevado conceito pelo qual os dados da DSC são mantidos na comunidade biofísica. É por esse motivo que a DSC é mais conhecida como “padrão de ouro”.
Um comentário de um dos nossos clientes destaca a utilidade da DSC:
“DSC é o método mais eficiente, informativo e relevante de todos os métodos biofísicos disponíveis no momento.”
Sorina Morar-Mitrica, Ph.D - GlaxoSmithKline; The BioProcessing Summit, 2012
Em alguns casos, essas tecnologias alternativas não geram dados de boa qualidade. Também há muitos casos em que elas não foram muito úteis. Por razões óbvias, os exemplos são raramente publicados.
Todos os fornecedores usam seus próprios jargões e têm formas diferentes de apresentar instrumentos e especificações. No entanto, todas as considerações sobre os instrumentos que você pode usar para medir a estabilidade da sua proteína deve começar com o entendimento dos requisitos específicos da sua aplicação e como as especificações e as características do produto têm impacto neles.
A maioria dos fornecedores de tecnologias não-calorimétricas para estabilidade de proteínas posicionam diretamente seus produtos em relação à DSC. Embora alguns desses produtos tenham vantagens específicas em termos de redução de consumo de amostra por cada processamento, este é o custo do conteúdo de informações e reprodutibilidade. Não é vantajoso salvar amostras quando os dados gerados são incorretos e causam uma tomada de decisões ineficiente. A repetição de grandes partes do projeto de desenvolvimento, devido aos dados ambíguos de estabilidade de proteínas, tem custos altos.
1.Quero ser capaz de usar o instrumento para avaliar a estabilidade de todos os candidatos de proteínas/produtos bioterapêuticos?
A DSC pode ser aplicada à análise de todas as proteínas, independentemente do número ou da posição de resíduos de triptofano presentes.
Outras tecnologias que medem fluorescência intrínseca são apenas os ensaios indiretos de estabilidade de proteínas. Eles medem é alteração na polaridade do ambiente de um resíduo de triptofano conforme o desdobramento da proteína.
Há uma série de problemas com essa abordagem. A alteração no ambiente desse resíduo de aminoácido específico deve representar o desdobramento da molécula inteira. Ou seja, o resíduo de triptofano precisa ser inserido no núcleo da proteína e estar presente em todos os domínios de uma proteína. Na realidade, talvez esse não seja o caso. A estabilidade estrutural de um subdomínio que não inclui um resíduo de triptofano não será avaliada, o que pode resultar na formulação ou seleção de candidatos incorreta, que terá impacto no próximo departamento no canal de desenvolvimento. Algumas proteínas não incluem resíduos de triptofano e, portanto, não podem ser analisadas com os métodos de fluorescência intrínseca.
Figura 1: Termogramas de DSC para um candidato biológico. Esses dados mostram o desdobramento térmico de um anticorpo em tampões diferentes. Os perfis mostram ressaltos distintos que representam o desdobramento das regiões CH2, CH3 e Fab do anticorpo. As condições de formulação usadas no painel inferior foram selecionadas para utilização devido ao mais alto TMe ao mais baixo T1/2
2.Quero ser capaz de caracterizar a estabilidade de todos os domínios individuais em uma proteína com vários domínios?
Devido à alta reprodutibilidade da DSC e sua capacidade de monitorar mudanças estruturais da proteína inteira, pode ser usada para medir claramente a estabilidade de subdomínios individuais. Algumas técnicas espectroscópicas geram perfis de estabilidade de proteínas que contêm informações sobre subdomínios, mas há também muitos casos em que não podem fornecer esses dados e onde são ocultas em algumas mudanças estruturais. Isso ocorre porque os resíduos de triptofano não são distribuídos por toda a proteína de forma ideal para a detecção fluorescente; alguns domínios terão resíduos de triptofano inseridos e outros não. Talvez isso seja importante caso um instrumento esteja oculto para a primeira transição e selecione incorretamente um tampão de formulação ou candidato porque ocorreram alterações estruturais na proteína que não eram visíveis para a técnica usada para medição. DSC é uma técnica genérica, global e de alta resolução para medir a estabilidade de proteínas e não apresenta esses tipos de problemas.
Figura 2: O desdobramento térmico de um anticorpo conforme observado pela detecção de fluorescência intrínseca. O perfil não tem transição e foi insuficiente para a determinação de TM
Outra vantagem de usar a DSC para monitorar a estabilidade de subdomínio de anticorpos é que o tamanho do domínio de ligação de Fab normalmente é maior do que os domínios CH2 e CH3, o que facilita a identificação. A amplitude do sinal para a maioria das técnicas espectroscópicas não é específica do domínio; portanto, entender qual domínio é estabilizado ou desestabilizado não é trivial. Isto é particularmente importante para projetos de engenharia de proteínas e seleção de candidatos em que é vital entender a parte do biológico que está sendo afetada.
3.Quero meus dados livres de artefatos experimentais que podem afetar os resultados?
Muitos métodos com baixo consumo de amostra usam fluorescência como uma medida indireta da estabilidade de proteínas. Além das questões anteriores, a fluorescência sofre com determinados artefatos; especificamente resfriamento, filtragem interna, agregação e espalhamento de luz, que mudam em função da concentração de amostra. Isso tem duas consequências importantes. Primeira: é muito difícil obter dados reproduzíveis quando dados são comparados em dias e em laboratórios diferentes porque é complexo e demorado ter a garantia de que todos os co-solutos estejam em concentrações idênticas. Segunda: esses artefatos podem afetar a forma das curvas de desdobramento, o que torna as análises diferentes de um processamento para outro, extremamente subjetivas e exigem muito conhecimento para que sejam interpretadas corretamente.
Alguns ensaios espectroscópicos de estabilidade de proteínas exigem o uso de corantes para monitorar a estabilidade das proteínas. Esses ensaios têm os mesmos problemas da fluorescência intrínseca, mas o corante pode afetar a estabilidade da proteína ou um componente de tampão pode afetar a extensão da interação do corante com a proteína. Isto pode resultar em perfis de estabilidade que refletem a interação do corante com a proteína mais complicada por interferência de um componente de tampão e que têm pouca relação com a estabilidade das próprias proteínas. Também é válido para as aplicações em que os perfis de estabilidade são utilizados como um método indireto para a triagem de pequenas moléculas ligadas a possíveis alvos de fármacos.
O fato de a DSC ser uma técnica de princípios que mede a estabilidade da proteína inteira - uma técnica verdadeiramente global - significa que ela não é afetada pelas limitações descritas acima.
4.Quero dados reproduzíveis?
A DSC é conhecida como o “padrão de ouro” de ensaios da estabilidade de proteínas devido aos dados altamente reproduzíveis que ela fornece. Por isso, a DSC é usada para estudos de biossimilaridade e biocomparabilidade. É uma tecnologia importante em uma aplicação recente e bem-sucedida para a aprovação do medicamento bioterapêutico, Remsima, um biossimilar do Remicade. Outro exemplo é o trabalho de um grupo, na Amgen, que considerou a DSC como a melhor técnica para identificar um produto bioterapêutico oxidado. O sucesso dessa aplicação deve-se à elevada reprodutibilidade de dados da DSC e ao fato de que a DSC pode detectar até mesmo mudanças sutis na estrutura de ordem mais alta de uma proteína com vários domínios.
A DSC também está sendo investigada pela sua utilidade como uma ferramenta de diagnóstico para identificar pacientes com diversas formas de câncer. A reprodutibilidade da DSC é a chave dessa aplicação. A seguir, há uma citação do cientista principal da equipe que executou o trabalho, destacando a alta reprodutibilidade dos dados da DSC que ele atingiu com Malvern MicroCal VP-Capillary DSC:
“Apropriada principalmente para realizar grandes conjuntos automáticos de amostras e para minimizar erros humanos/acidentais.”
“Caracterizada por uma incrível reprodutibilidade de leitura e uma sensibilidade impressionante para reduzir o uso de amostra.”
“Simples de programar com o software de controle.”
“Fácil de manter a forma ao programar varreduras de limpeza/controle periódicas.”
Adrian Velazquez-Campoy - Institute BIFI - Universidade de Saragoça, Espanha
5.Quero medir a estabilidade do meu biológico em vários tampões ou co-solutos?
Algumas tecnologias têm requisitos muito específicos para tampões e/ou co-solutos compatíveis. Dicroísmo circular é um bom exemplo dessa limitação, porque alguns tampões, como os usados nos estudos de formulação, absorvem luz nos mesmos comprimentos de onda que a proteína, o que causa a saturação do sinal. Além disso, o uso de quantidades muito pequenas de detergentes, um componente comum de tampões de formulação, é incompatível com a maioria das tecnologias baseadas fluorescência.
A DSC é uma técnica não espectroscópica e não é afetada por esses problemas.
6.Preciso caracterizar proteínas com elevada estabilidade térmica?
A DSC foi projetada especificamente para acomodar e medir diversas estabilidades térmicas de proteínas e para funcionar em temperaturas baixas e altas. Por outro lado, as técnicas espectroscópicas não podem ser usadas abaixo de 20°C ou acima de 90°C. O aparecimento da desnaturação térmica de proteínas termicamente lábeis ocorre abaixo da temperatura ambiente e pode ser perdido por técnicas espectroscópicas. No outro extremo do espectro, mesmo que muitas proteínas tenham um TM ou um ponto intermediário da transição térmica inferior a 90°C, uma temperatura de 20°C mais alta é normalmente necessária para que o ponto final possa ser determinado com precisão.
Isso significa que você precisa usar a DSC caso o TM seja ~70°C para qualquer uma das suas proteínas.
7.Quero dados simples de analisar?
Malvern MicroCal VP-Capillary DSC usa software de análise automática, removendo subjetividade e minimizando o requisito de especialização. Os resultados de muitas tecnologias concorrentes podem ser subjetivos e difíceis de analisar. Isto é evidente na análise de proteínas com vários domínios, como os anticorpos.
“A alta produtividade é suportada pelo software de análise, que é fácil de usar e não precisa de mais cálculos manuais, o que nos poupa horas. Essa economia de tempo melhorou muito nosso fluxo de trabalho.”
Katherine Bowers - Fujifilm Diosynth Biotechnologies
8.Quero detectar mudanças sutis na estabilidade da minha proteína?
A DSC pode detectar alterações em todos os níveis da estrutura de proteínas (primária, secundária, terciária e quaternária) E é extremamente reproduzível. Isso significa que a DSC detectará alterações muito pequenas em TM e na estrutura de ordem mais alta (HOS).
Um exemplo mais recente mostrou que o termograma da DSC de uma proteína com vários domínios foi a melhor abordagem para detectar níveis baixos e indesejados (< 5%) do produto bioterapêutico oxidado, em relação a muitas técnicas espectroscópicas (Arthur et al, (2015) J Pharm Sci, Vol 104, 1548–1554).
9.Qual é a qualidade do fabricante ou fornecedor?
É importante avaliar a reputação do fabricante ou fornecedor que você usa para garantir seu investimento em qualidade.
Os instrumentos da DSC devem ser fabricados com padrões elevados e projetados por empresas sólidas e líderes em tecnologia, a fim de proporcionar a qualidade da publicação ou os resultados da tomada de decisões.
Escolha um fabricante com um histórico apropriado na liderança do desenvolvimento e da otimização dessas tecnologias. Essas empresas produzem instrumentos com variabilidade adequada de máquina para máquina e, normalmente, são as primeiras a desenvolver avanços inovadores na tecnologia e em suas aplicações. Elas têm experiência e recursos de suporte não só para criar instrumentos excelentes, mas também oferecer suporte de forma adequada.
10.E o suporte e o serviço pós-venda?
A compra de um instrumento é apenas o começo de uma longa relação com o fornecedor/fabricante. Por isso, é importante adquirir um sistema de uma empresa que ofereça um serviço aceitável e um suporte pós-venda.
Escolha uma empresa que forneça telefone, suporte por e-mail ou presencial, oportunidades de treinamento contínuo, serviço em campo e suporte especializado. Antes de adquirir um instrumento, pergunte sobre o suporte oferecido para entender a qualidade do atendimento que você poderá ter quando tiver seu novo instrumento instalado no laboratório.
Aplicação/requisito | MicroCal DSC | Dicroísmo circular | Fluorescênciaintrínseca | Fluorescênciaextrínseca |
Geral para todas as proteínas | Sim | Sim | Não | Não |
Sensível a todos os níveis de estrutura de proteína | Sim | Não | Não | Não |
Leitura quantitativa diretamente proporcional à quantidade de material | Sim | Sim | Não | Não |
Ensaio global de estabilidade de proteínas, de alta resolução | Sim | Não | Não | Não |
Várias métricas de estabilidade de proteínas | Sim | Não | Não | Não |
Impressão digital do perfil de desdobramento | Sim | Não | Não | Não |
Livre de artefatos ópticos | Sim | Não | Não | Não |
Altamente reproduzível | Sim | Não | Não | Não |
Não é necessário para corantes, rótulos ou aditivos químicos | Sim | Sim | Sim | Não |
Livre de interferência de tampão e co-soluto | Sim | Não | Não | Não |
Medida de TMs acima de 70°C | Sim | Não | Não | Não |
Medidas de TM de padrão de ouro | Sim | Não | Não | Não |
A tabela anterior ilustra claramente por que a DSC é amplamente utilizada em todo o setor biofarmacêutico e é considerada o “padrão de ouro” para a medida de estabilidade de proteínas. Esta afirmação é apoiada em um artigo recente, que detalha as respostas de profissionais do setor quando solicitados para classificar a utilidade de tecnologias para aplicações importantes no canal do desenvolvimento de produtos biofarmacêuticos (Gabrielson and Weiss IV (2015), Journal of Pharmaceutical Sciences 104:1240–1245). As aplicações variaram de seleção de candidatos e desenvolvimento de formulação a biossimilaridade e comparabilidade.
É claro que a DSC é a técnica mais adequada do mundo para avaliar a estabilidade dos biológicos.
Embora algumas técnicas não espectroscópicas tenham menos consumo de amostra que a DSC, não são adequadas para esta aplicação, devido a deficiências inerentes, incluindo (mas não se limitando a) interferência de corante, espalhamento, filtragem interna, sinal fraco/sem sinal e informações estruturais de subdomínio definidas incorretamente.
Muitas dessas falhas e incompatibilidades podem resultar em decisões de alto custo e inferiores que, por sua vez, dão origem a projetos de reabilitação e/ou não desenvolvem um biofármaco.
A DSC de Malvern MicroCal fornece dados de estabilidade livres de artefatos e reproduzíveis, com padrão de ouro, para cada proteína em cada tampão.
