Aceleração do desenvolvimento de formulações de proteína terapêuticas otimizadas utilizando Calorimetria de varredura diferencial

É necessário estabilizar as biomoléculas para uso terapêutico em suas formas nativas e ativas diretamente para a administração ao paciente e entrega ao local de ação. A seleção de estabilidade de formulações biofarmacêuticas em uma etapa inicial ajuda a garantir que os futuros investimentos sejam focados nas formulações que demonstraram o melhor potencial para outros desenvolvimentos de fármacos. A calorimetria de varredura diferencial (DSC) é uma técnica que pode ser utilizada para determinar rapidamente as condições de solução ideal para estabilidade da formulação da proteína, ajudando a identificar os melhores candidatos de formulação e acelerar o desenvolvimento. Essa nota de aplicação descreve a tecnologia MicroCal DSC da Malvern e seu uso em desenvolvimento de formulação. 

Introdução

Uma das primeiras decisões a serem tomadas no desenvolvimento de produtos biofarmacêuticos é decidir se o produto será fornecido na versão líquida, ou como um pó liofilizado (congelado). Em geral, as formulações líquidas são mais econômicas para produção e fáceis de usar, mas devem ser armazenadas sob condições refrigeradas e tendem a ser mais instáveis. As proteínas congeladas são mais onerosas para produção e requerem uma dissolução anterior à administração a paciente, mas podem ser armazenadas a temperatura ambiente e podem oferecer uma estabilidade maior. A conveniência para o usuário final também é um fator a ser considerado (1,2). O cientista responsável pela formulação deve determinar se a proteína pode se manter estável em solução por um período de tempo suficiente, ou se é possível manter sua estabilidade somente na forma congelada.

Uma proteína em solução aquosa está em equilíbrio entre suas conformações nativas (dobradas) e desnaturadas (desdobradas). As interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio são as principais forças estabilizantes, que devem ser superadas para o desdobramento e a desnaturação da proteína. A entropia conformacional enfraquece as forças estabilizantes, permitindo o desdobramento do biopolímero (3). As proteínas desdobradas mediante o aquecimento ou a desnaturação de substâncias químicas (como sulfato dodecil sódico e hidrocloreto de guanidina) são adicionadas à solução. As proteínas desnaturadas tendem a ser mais suscetíveis (4-7) a processos químicos irreversíveis como proteólise (8), oxidação (9) e desaminação (10), que podem resultar em inativação. Uma proteína desnaturada também apresenta uma maior tendência para agregação; e a agregação pode, da mesma maneira, causar a perda de estabilidade e quebra da proteína (11-14).

A proteína deve ser caracterizada antes do desenvolvimento da formulação. Isso pode incluir a determinação de seu peso molecular, composição do aminoácido, estrutura tridimensional, presença de ligações de dissulfeto, glicosilação, requisitos de cofatores, inibidores, solubilidade, parâmetros termodinâmicos, funcionalidade, ponto isoelétrico, hidrofobicidade e área da superfície. Todas essas informações são valiosas para o desenvolvimento da formulação ideal da proteína. Por meio de uma abordagem de desenvolvimento de fármaco racional, as proteínas produzidas por bioengenharia também podem ser construídas para estabilidade máxima e maior eficácia na solução de escolha.

A formulação líquida da proteína dever ser favorável para manter a estabilidade e bioatividade do biopolímero durante a produção, embalagem, armazenamento e remessa, até que a entrega final ao local alvo do paciente. Os parâmetros a serem considerados durante o desenvolvimento da formulação incluem concentração da proteína, presença de aditivos (excipientes), pH, temperatura de armazenamento, recipiente, exposição à luz, ao ar e à umidade.

Outro fator no desenvolvimento da formulação envolve o mecanismo de aplicação do fármaco. Por exemplo, um produto biofarmacêutico aplicado por via intravenosa deve ser diluído, e se a proteína não for muito solúvel, ele poderá se precipitar na corrente sanguínea do paciente. Além disso, se o fármaco for injetado, a composição da formulação não deverá causar danos ao tecido ou dor ao paciente. Outra consideração é a absorção potencial de proteína no recipiente ou na superfície do instrumento (seringa, bomba etc.).

A estabilidade da proteína é normalmente determinada por meio de vários métodos analíticos, inclusive estudos de estabilidade acelerados e em tempo real. Também é normalmente avaliada a extensão da agregação/precipitação, oxidação, degradação proteolítica e/ou reorganização da ligação de dissulfeto. As condições de transporte são testadas para garantir que o fármaco será entregue sem perda de bioatividade.

DSC e desenvolvimento da formulação

A Calorimetria de varredura diferencial (DSC) é uma técnica de microcalorimetria usada para caracterizar a estabilidade de uma biomolécula diretamente em sua forma nativa. Ela faz isso por meio da medição da troca de calor associada à desnaturação térmica da molécula quando aquecida a uma taxa constante. A medição do ponto médio de transição térmica (T_m) fornece uma indicação rápida e fácil de estabilidade. Quanto maior o T_m, mais estável é a biomolécula.

O instrumento de DSC apresenta uma célula de amostra que contém biomoléculas e tampão, além de uma célula de referência preenchida somente com o tampão. Os aquecedores são alimentados para aumentar a temperatura das células a uma taxa constante. Durante esse aumento de temperatura, o instrumento monitora a diferença de temperatura entre a célula de amostra e a de referência. A diferença na absorção de calor entre as células necessárias para manter as temperaturas idênticas em ambas as células determina a capacidade térmica excessiva aparente (figura 1). O ponto intermediário de temperatura (T_m) da transição para a troca de entalpia ocorre quando a proteína se modifica de sua forma nativa para a desnaturada. No T_m, 50% das proteínas estão no estado nativo, e 50% estão no estado desnaturado, assumindo uma transição de dois estados (figura1). Algumas proteínas com diferentes regiões de atividade ou mais de um domínio estrutural podem ter mais de um T_m . O cientista pode se concentrar em um ou mais valores de T_m que mostram os principais efeitos gerados por alterações na formulação.

O T_m é um indicador de estabilidade térmica e, em geral, quanto mais alto o T_m, mais estável será a proteína. Com um T_m mais alto, a proteína estará menos suscetível ao desdobramento e à desnaturação a temperaturas mais baixas também. Ao avaliar várias condições e aditivos, a DSC pode determinar formulações com o T_m mais alto que corresponderá à(s) formulação(ões) ideal(is) para estabilidade (4,5,7,15,16).

Durante um processo químico, o calor é libertado (exotérmico) ou absorvido (endotérmico). A transição de proteína nativa para desnaturada é geralmente endotérmica. A modificação na entalpia (∆H) durante a transição conformacional é medida pela integração da área sujeita à transição (figura 1). A capacidade térmica (C_p) da proteína desnaturada é normalmente superior à da proteína nativa, resultando em uma ∆C_p positiva para desnaturação térmica (figura 1).

Figura 1: Termograma de DSC típico. Essa DSC foi realizada em solução de proteína diluída, em que a proteína experimenta uma transição de um estado compacto e nativo a uma baixa temperatura para outro desdobrado e desnaturado a alta temperatura. A capacidade térmica excessiva aparente da proteína foi medida com base na diferença de capacidade térmica da proteína no tampão e do tampão sozinho. O Tm, ∆H e ∆Cp da transição foram calculados por meio do ajuste dos dados a um modelo de dois estados, utilizando uma análise de regressão dos mínimos quadrados não linear.

O MicroCal™ VP-Capillary DSC da Malvern (figura 2) e os sistemas MicroCal VP-DSC da Malvern são utilizados no estudo de biopolímeros em solução. O sistema MicroCal VP-Capillary DSC da Malvern foi desenvolvido especificamente para seleção de T_m de diferentes formulações a um alto rendimento de amostra (até 50 amostras em 24 h), com uma taxa de varredura rápida (até 250 °C/h). Um amostrador automático totalmente integrado permite a operação sem supervisão. Veja a Tabela 1 para obter uma comparação dos recursos dos sistemas MicroCal VP-Capillary DSC e MicroCal VP-DSC da Malvern.

##Figura 2: Sistema MicroCal VP-Capillary DSC da Malvern.

Estratégias de formulação líquida

No desenvolvimento de formulação, a questão principal é determinar quais condições de solução oferecem maior estabilidade à proteína nativa. As condições que resultam no maior T_m normalmente mantêm a proteína em seu estado nativo por mais tempo, a temperaturas mais baixas também. Utilizando DSC, diferentes condições de pH e tampão são selecionadas primeiro, seguidos de excipientes e conservantes.

Otimização de tampão e pH

Na Figura 3, o T_m da proteína CD40L é apresentado em um gráfico em relação ao pH. A agregação de CD40L também foi determinada após a incubação a 37 °C por 7 dias. O T_m indicou excelente correlação com as condições de pH em que a agregação foi reduzida (16). Essa correlação entre pH, T_m e agregação também foi observada com fator estimulante de colônias macrófagas (4).

Figura 3: Comportamento da estabilidade da resposta de agregação correlacionada (A) do ligante CD40 (CD40L) conforme determinado pela cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), e (B) o Tm determinado por DSC como uma função de pH. A área entre colchetes representa a faixa ideal de pH, em que Tm é aumentado e a agregação é diminuída. De (16).

A medição das alterações de T_m das proteínas por DSC é um processo relativamente simples. A figura 4 mostra alterações de T_m de quimotripsinogênio quando há um aumento no pH, conforme medido pelo MicroCal VP-Capillary DSC da Malvern. O T_m aumentou em conformidade com o aumento do pH, indicando uma maior estabilidade da forma nativa de quimotripsinogênio a um pH mais alto.

Figura 4: Modificação do Tm do quimotripsinogênio com o pH. As soluções de quimotripsinogênio (pH 1,96, 2,27, 2,57 e 3,02) foram preparadas e adicionadas a uma placa de 96 poços. Foram utilizadas cinco amostras para cada pH. Tampões de referência compatíveis também foram colocados na placa de 96 poços. As varreduras DSC foram realizadas com MicroCal VP-Capillary DSC da Malvern. Os dados da DSC mostrados aqui foram obtidos após a subtração da varredura de referência tampão a tampão. São apresentados os dados do Tm de cada pH e o desvio padrão.

Excipientes

Excipientes são aditivos que podem melhorar a estabilidade da proteína. Eles incluem açúcares, aminoácidos, antioxidantes, polímeros, álcoois, glicerol e surfactantes.

Após a determinação do pH e tampão ideais, são adicionados diferentes excipientes à solução de proteína. Se um excipiente aumentar o T_m, a forma nativa da proteína será mais estável com o excipiente do que sem ele.

A seleção de excipiente foi utilizada durante o desenvolvimento da formulação líquida do receptor interleucina-1, IL-1R (5). Há duas principais transições para IL-1R, uma com T_m próximo a 48 °C e outra próxima a 66 °C. A transição com o T_m à temperatura mais baixa foi escolhida para a seleção de excipientes. A estratégia consistiu em identificar excipientes que aumentariam o T_m da transição de temperatura baixa, indicando uma mudança positiva na estabilidade da proteína nativa. Foram selecionados vinte e três excipientes (Tabela 2).

Força iônica

A força iônica do tampão é ajustada para determinar se é possível aumentar T_m por meio da adição de sódio. Para IL-1R, a adição de 100 mM NaCl teve a maior influência, com uma força iônica pequena modificando o T_m de 48 °C para 53 °C. Esse efeito estabilizante sugeriu uma interação direta entre íons de sódio e grupos carregados da proteína (5). O T_m de IL-1R continua aumentando com uma quantidade maior de sódio, mesmo quando NaCl for 1.500 mM, bem acima da concentração necessária para saturar todos os locais carregados (figura 5). Esses dados sugerem que íons de sódio afetam a estrutura da água, que também desempenha uma função na estabilidade conformacional da proteína. Tanto as interações carga a carga quanto as alterações na estrutura da água adicionam estabilidade à estrutura IL-1R nativa.

Figura 5: Gráfico mostrando Tm de IL-1R com adição de NaCl. A concentração de 100 mM é mostrada pela linha pontilhada. De (5).

Conservantes

Quando um fármaco é fornecido em um formato de múltiplas doses, os conservantes são adicionados para ajudar a conservar o crescimento microbiano. No entanto, os conservantes podem ter um efeito desestabilizante na proteína. O efeito dos conservantes no T_m de IL-1R também foi examinado (5). Os conservantes de metacresol, fenol e álcool benzílico desestabilizaram IL-1R, com base na mudança de ambas as transições de temperatura para temperaturas mais baixas (tabela 3). Os dados da DSC determinaram a ordem da estabilidade de IL-1R nos três conservantes - o fenol produziu o T_m mais alto, seguido de metacresol e álcool benzílico. Os dados de estabilidade da DSC também se correlacionaram à agregação de IL-1R, conforme medido pela cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Quanto mais alto o T_m, menos agregação foi observada após sete e 60 dias.

Os melhores candidatos de formulação, com base na seleção de T_m, são avaliados em seguida por estudos de estabilidade acelerados. A proteína é preparada em diferentes formulações e depois armazenada a 37 ºC. A quantidade de agregação é determinada pela cromatografia por exclusão de tamanho em intervalos durantes o estudo de estabilidade acelerado, e a proteína é analisada utilizando SDS-PAGE para verificar a proteólise.

Finalmente, os melhores candidatos de formulação devem ser submetidos a estudos de estabilidade em tempo real para determinar a vida útil da proteína. Análises biológicas e testes analíticos são realizados durante todo o estudo para garantir que a proteína permaneça ativa e viável.

Por muitos anos, a DSC foi utilizada como uma ferramenta de seleção para avaliar a estabilidade da proteína durante o desenvolvimento da formulação, e o uso do MicroCal VP-Capillary DSC da Malvern permite a seleção mais rápida com um rendimento maior, se comparado ao MicroCal VP-DSC da Malvern (tabela 1). O MicroCal VP-Capillary DSC da Malvern foi utilizado para determinar o T_m de proteínas em diferentes pHs e excipientes, e as alterações no T_m apresentaram correlação com os dados da SEC, oferecendo suporte ao uso da DSC como uma ferramenta de seleção de estabilidade (17).

Resumo

Os dados de DSC são úteis para prever a estabilidade de uma proteína na solução. O T_m indica estabilidade térmica, e a determinação do T_m em diferentes formulações é uma medida aproximada da suscetibilidade para agregação e outras alterações irreversíveis a temperaturas mais baixas. São escolhidas as formulações com as melhores estabilidades térmicas para estudos posteriores de estabilidade, vida útil e transporte. O uso de DSC pode economizar tempo e dinheiro em desenvolvimento de formulação, e sistemas totalmente automatizados oferecem maior eficiência e produtividade nessa área crítica do desenvolvimento do fármaco.

Referências

1. BioPharm Guide to Formulation, Fill and Finish, 2001, supplement to BioPharm (Advanstar Communications).

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