Utilização de DSC para estudar estabilidade da região Fab de anticorpos para desenvolvimento bioterapêutico otimizado

Introdução

A estabilidade é um problema crucial para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos e fragmentos de anticorpos adaptados geneticamente. A baixa estabilidade pode afetar os níveis de expressão de anticorpos em diferentes tipos de célula, resultar no preenchimento fracionado de material não funcional ou com problemas de dobramento, ou causar a formação de agregados grandes e potencialmente imunogênicos ao longo do tempo.

Os anticorpos e proteínas semelhantes a anticorpos representam um número grande e crescente de entidades moleculares inclusas nos testes clínicos humanos em praticamente todas as indicações patológicas. Os anticorpos são heterotetrâmeros compostos de cadeias leves e pesadas. Os domínios constantes (cadeias de C_H e C_L) contêm sequências de aminoácidos invariáveis que dependem de isotipos e subclasses de anticorpos. Em contraste, os domínios de anticorpos variáveis são extraordinariamente diversificados, permitindo o reconhecimento de praticamente qualquer antígeno com alta especificidade e afinidade. A diversidade do domínio variável é obtida por meio do pareamento de cadeias pesadas (V_H) e leves (V_L, kappa ou lambda), várias sequências vinculadoras entre domínios variáveis e constantes e mutação hipersomática. A diversidade em domínios variáveis também pode resultar em variações de estabilidade de um anticorpo para outro.

Até recentemente, houve uma escassez relativa de dados referentes a anticorpos completos, possivelmente devido ao fato de que se tratam de proteínas complicadas e de domínios múltiplos. Aqui, investigamos as propriedades de desdobramento dependentes de domínio de 17 anticorpos humanos ou humanizados IgG₁ e IgG₄ utilizando Calorimetria de varredura diferencial (DSC) (1). Essa investigação incluiu Tysabri™ (clinicamente aprovado para o tratamento de esclerose múltipla), sete moléculas nos testes da fase I ou II, quatro moléculas rastreadas para nova droga investigacional (IND) registrada no FDA em 2007 e seis moléculas sob pesquisa. O conjunto de dados pode ser utilizado como um guia de referência para ajudar pesquisadores no campo de descoberta de anticorpos a entenderem se a estabilidade térmica pode ser um problema para determinada molécula de anticorpo.

A segunda parte dessa nota de aplicação descreve um processo para reverter a estabilidade para um anticorpo particularmente instável. Uma combinação de mutações estabilizantes resultou em um Fab com um ponto intermediário de desdobramento térmico (T_m) de 92 °C medido pela DSC. A estabilização resultou em uma expressão funcional altamente aprimorada do fragmento do anticorpo no E. coli (2).

Material e métodos

O material e os métodos empregados neste estudo foram descritos anteriormente (1,2). O trabalho de DSC foi realizado utilizando um sistema Malvern MicroCal VP-DSC.

Fig 1. (A) Curva DSC do BIIB7 IgG₁. Acima das curvas estão as estruturas de um anticorpo humano completo IgG₁ (13). (B) Curvas DSC representando as quatro subclasses IgG humanas. Reimpresso de (1) com a permissão de Elsevier.

Fig 2. (A) Curvas de desdobramento térmico de DSC de quatro anticorpos humanos ou humanizados de IgG₁, BIIB16, BIIB6, BIIB4 e BIIB1. (B) Curvas de desdobramento de DSC do anticorpo BIIB7 nos formatos IgG₁ e IgG₄. Reimpresso de (1) com a permissão de Elsevier.

Medições de estabilidade de Fab de 18 sequências humanas ou humanizadas de IgG

Como seus domínios constantes são praticamente idênticos, IgGs de subclasses similares variam em estabilidade conforme as diferenças de suas regiões Fv. Para investigar a variedade de estabilidades Fab IgG existentes para anticorpos humanos ou humanizados, particularmente IgG₁, foram realizados estudos de DSC utilizando um painel de 18 anticorpos completos humanos (humanizados), denotados como BIIB1–18. As transições Fab geralmente apresentaram valores CP_máx (p.ex., a altura de um pico de DSC) aproximadamente três dobramentos maiores em relação aos domínios C_H2 ou C_H3, conforme mostrado pelo traço de DSC de BIIB7 (Fig 1A). Os traços de DSC característicos das quatro subclasses IgG humanas são mostrados na figura 1B com IgG₁ demonstrando a estabilidade Fc de anticorpo aparente mais alta. A agregação durante o processo de desdobramento afeta o T_m de Fab medida pela DSC (3,4); portanto, cada varredura de DSC foi realizada sob condições idênticas para cada anticorpo, e as informações obtidas foram consideradas uma medida relativa da estabilidade de cada domínio.

As transições Fab BIIB1-18 apresentaram variações significativas de estabilidade térmica relativa como resultado das diferenças de suas regiões Fv. As curvas DSC mostradas na figura 2A ilustram como regiões Fv individuais podem gerar comportamentos de desdobramento de Fab diferentes. A faixa de valores de T_m de Fab para os anticorpos 18 BIIB foi 57,2 °C a 81,6 °C (Tabela 1). Os três anticorpos com os valores de T_m de Fab mais baixos, BIIB15-17, demonstraram transições de desdobramento múltiplas para seus Fabs, sugerindo uma ruptura na cooperação de desdobramento (veja a Fig 2A para a curva da DSC de BIIB16). O pico de Fab para esses anticorpos foi divido em duas transições. As transições com o Tm mais baixo estão listadas na tabela 1. Uma segunda transição, que pode representar o desdobramento de C_H1/C_L, ocorreu com valores de T_m 74 °C, 72 °C e 70 °C para BIIB15, BIIB16 e BIIB17, respectivamente.

Embora os estudos de DSC tenham sido realizados com proteínas heterotetraméricas ideais conforme determinado por cromatografia por exclusão de tamanho, o anticorpo com o Fab menos estável, BIIB17, teve pouca expressão e acumulou agregados moleculares pesados ao permanecer em solução a 2 ºC a 8 ºC por mais de uma semana. As transições de desdobramento de C_H2 e C_H3 de cada IgG₁ se sobrepuseram bem (traços de DSC representativos mostrados na Fig 2A). O mesmo se aplicou a transições de C_H2 e C_H3 todos três IgG₄ (dados não mostrados).

BIIB7 foi construído como IgG₁ e IgG₄. As sequências de IgG₁ e IgG₄ C_H1 apresentam dez diferenças de aminoácidos (seis são conservadores) e um padrão diferente de ligação de dissulfeto com C_L. Os valores de T_m do Fab aparentes de BIIB7 nos formatos IgG₁ e IgG₄ foram similares (ΔT_m < 1°C, Fig 2B) após a deconvolução dos picos. Essa similaridade sugere que as termoestabilidades de Fab entre IgG₁ e IgG₄ podem ser comparadas diretamente.

Engenharia de resíduos de Fab para melhorar a estabilidade

Sabe-se que as proteínas podem ser estabilizadas com design consensual - a mutação de aminoácidos raros para aminoácidos consensuais encontrados em sequências de proteínas homólogas. Como suporte a esses resultados, os anticorpos BIIB humanizados com a estabilidade mais baixa, conforme determinado pela DSC, pareceram apresentar os níveis mais altos de tipos de aminoácidos incomuns em suas estruturas. Em um esforço para desenvolver estratégias de estabilização de fragmentos de anticorpo, selecionamos um Fab com comportamento deficiente e organizamos uma campanha de mutagênese para que a estabilidade retorne ao Fab. Começamos com um Fab que reconhecesse toxoide tetânico (αTT) e fosse derivado de uma fonte humana (5). Escolhemos 45 posições residuais para randomização. Os detalhes completos dessa campanha de mutagênese de saturação são descritos em (2).

Fig 3. A análise da DSC do Fab αTT do tipo selvagem e todos os 12 Fabs contendo várias combinações mutantes, inclusive V11, o Fab mais estável. A identidade de cada curva pode ser derivada com base no ΔT_m listado na tabela 2. Reimpresso de (2) com permissão da Oxford University Press.

Seleção de mutagênese e tolerância térmica da biblioteca do Fab αTT

As 45 reações PCR dos mutantes foram transformadas individualmente, e cerca de 4.500 colônias individuais foram selecionadas e cultivadas em placas de 96 poços com meio de expressão. Sobrenadantes com Fab foram testadas em três temperaturas diferentes; 70 ºC, 72 ºC e 74 ºC (2). As variantes que demonstraram termoestabilidade aprimorada foram submetidas novamente, em duplicata, à seleção de tolerância térmica para confirmar suas propriedades.

Há uma lista completa das mutações estabilizantes em (2). Aproximadamente 1% das variantes na biblioteca exibiu uma termoestabilidade aprimorada. Quatorze das "ocorrências" estavam localizadas no domínio V_H, e as quatro restantes no domínio V_L. Esse resultado sugere que a estabilidade do Fab nativo foi limitada pela estabilidade marginal do V_H. Surpreendentemente, nenhum mutante na biblioteca do domínio constante de ~2.000 membros pareceu estabilizar o Fab por inteiro. Consideramos que as mutações estabilizantes nos domínios constantes realmente ocorram, mas que a estabilidade limitada do domínio V_H controle a temperatura à qual o Fab se desdobra e nos impossibilitou de observar tais eventos. Veja os experimentos de DSC abaixo.

Outra explicação para a incapacidade de descobrir mutações estabilizantes na região C_L/C_H1 é, possivelmente, que o período de desdobramento de 10 minutos a temperaturas elevadas não foi suficiente para o desdobramento completo dos domínios constantes. Röthlisberger e seus colegas descobriram que o desdobramento do heterodímero C_L/C_H1 é extremamente lento (6) e que a estabilidade de todos os quatro domínios de Fab se beneficiam dessa estabilidade cinética. É possível, portanto, que os domínios constantes não se desdobrem durante o período relativamente curto do desafio térmico.

Embora muitas das mutações estabilizantes V_H não se mostraram compatíveis com o consenso geral, a maioria das mutações correspondeu ao consenso para, pelo menos, uma ou mais das outras subclasses da linha germinal de V_H (2). Por exemplo, a posição 72 em αTT V_H foi otimizada pela mutação para Asn. Seu resíduo consensual em todas as subfamílias da linha germinal V_H é o aminoácido isostérico Asp. Após o sequenciamento da placa da biblioteca para resíduo 72, foi descoberto que, felizmente, Asp não foi representado. Além disso, embora V89 seja o grande consenso na maioria das subfamílias V_H, a mutação para Val não melhorou a estabilidade de Fab. O resíduo consensual isostérico Thr de V_H2 se mostrou altamente estabilizante na seleção (ΔT_m > 2 °C). A Ile com ramificação beta semelhante foi uma das primeiras mutações estabilizantes descobertas na seleção e é encontrada somente ocasionalmente nessa posição em sequências V_H humanas, mas esse não é o resíduo consensual de todas as subclasses V_H.

Foram descobertos quatro mutantes estabilizantes no domínio V_L αTT. A mutação do resíduo consensual V_K4 W50 para Ala (o resíduo consensual de V_K1) ou His foi altamente estabilizante. A histidina é raramente encontrada na posição 50 em domínios variáveis kappa humanos, sendo geralmente encontrada em domínios variáveis lambda humanos. O resíduo está próximo da interface do domínio V_H/V_L. Nossa teoria é de que sua contribuição para a estabilidade de Fab esteja associada ao reforço do domínio V_H, já que o domínio V_H em particular parece limitar a estabilidade do Fab αTT (2). No entanto, os estudos com o domínio V_L isolado sugerem o contrário (dados não mostrados). Foi observado que a mutação de Tyr para His nessa posição melhora a estabilidade e expressão aparentes de um scFv sem um dissulfeto (7). Assim, parece que grandes grupos aromáticos em resíduo 50, o resíduo mais C-terminal de V_L estrutura 2,
onde não foram favoráveis para estabilidade de Fv em múltiplos casos.

Os resultados da combinação de mutações estabilizantes com o Fab αTT

Foram gerados doze construtos contendo entre três e onze mutações estabilizantes identificadas na seleção inicial (tabela 2). Várias combinações foram derivadas racionalmente para determinar a contribuição aparente que cada mutante fornece para a estabilidade de Fab.

Curiosamente, a introdução de várias mutações estabilizantes ao Fab αTT aumentaram a expressão do Fab em um experimento de transformação/expressão paralelo. Os melhores construtos exibiram consistentemente >aumentos de três dobras em rendimento expresso no tipo selvagem (tabela 2). A estabilidade de cada Fab foi avaliada pela DSC (Fig 3) e dicroísmo circular (CD) (dados não mostrados). As varreduras de DSC e CD foram universalmente irreversíveis, e as soluções se tornaram altamente túrbidas após o aquecimento. Devido à agregação dos Fabs, os valores medidos de T_m foram utilizados para classificar a estabilidade aparente do Fab.

O desdobramento acoplado de todos os quatro domínios é uma característica comum, porém não universal dos Fabs, desde que uma ligação com dissulfeto completa, seja intra ou intermolecularmente (1,3,6,8,9). O desacoplamento das reações de desdobramento de proteínas com domínios múltiplos baseados em diferenças significativas entre as estabilidades intrínsecas dos domínios individuais não é incomum e depende da afinidade geral dos domínios, um ao outro, e da superfície de interação total entre os domínios (10,11). Na ausência de qualquer porção do Fab, o desdobramento dos domínios restantes não será acoplado. Rowe e Tanford demonstraram que o V_L e C_L em uma cadeia kappa leve parecem se desnaturar de uma maneira desacoplada quando não estão ligados a uma cadeia pesada e, em vez disso, se desdobram como domínios
isolados (12). Parece que os contatos adicionais com uma cadeia pesada são necessários para cooperação. Röthlisberger e seus colegas relataram recentemente experimentos abrangentes e refinados que demonstraram como domínios variáveis com diferente estabilidade podem se desdobrar separadamente um do outro, enquanto os domínios variáveis com estabilidades altas e similares combinam as transições de desdobramento de todos os quatro domínios do Fab (6). O construto de Fab mais estável descrito aqui (T_m = 92 °C) pareceu estar a ponto de desacoplar as reações de desdobramento térmico de seus domínios variáveis também.

As temperaturas térmicas de todas as doze variantes do Fab foram utilizadas para deconvoluir a contribuição de estabilidade individual de cada mutação. Aparentemente, todas as mutações contribuíram adicionalmente para a estabilidade do Fab, mesmo que vários desses resíduos estejam relativamente próximos um do outro na sequência principal e na dobra terciária do Fab. A análise indicou que quatro mutações correspondem a quase 86% da estabilização do Fab. As mutações G24A, T72N e F89I no domínio V_H aumentaram individualmente o T_m do construto do Fab em 3,0 °C, 2,8 °C, e 2,8°C, respectivamente. A mutação W50H no domínio V_L aumentou a estabilidade térmica do Fab em 3,5 °C.

A estabilidade térmica do Fab se correlaciona à fração proteica funcional expressa por E. coli

Uma consideração importante posterior à mutagênese da estrutura foi o efeito potencial que isso poderia ter sobre a função vinculadora do antígeno do Fab αTT. As mutações de estabilidade térmica foram derivadas da seleção original utilizando uma ELISA quantitativa, detectando o domínio C_L e o complemento da histidina no terminal C de C_H1. Geralmente se especulou que a dinâmica de um domínio Fv pode ter um efeito profundo na ligação de um antígeno. Estávamos preocupados que as mutações estabilizantes introduzidas nas regiões de estrutura Fv poderiam interromper um equilíbrio dinâmico importante para fixar o antígeno.

As mutações estabilizantes não atenuaram a função da molécula expressa por E. coli, mas, na verdade, aumentaram a afinidade aparente do Fab αTT em uma ELISA funcional (tabela 2). As duas preparações de Fab do tipo selvagem separadas não foram tituladas igualmente com o antígeno em uma ELISA funcional, indicando que as pequenas variações durante a cultura celular podem controlar sutilmente o nível de expressão de Fab funcional. Ambas as preparações do tipo selvagem renderam uma quantidade de proteínas inferior à maioria dos construtos de Fab αTT estabilizados. A capacidade funcional de cada variante de Fab pareceu estar diretamente correlacionada à sua estabilidade conforme descrito pelo T_m (Fig 4). Como as mutações se mostraram distantes dos loops de ligação previstos, é improvável que esses resíduos aperfeiçoem o contato com o antígeno diretamente.

Com base no comportamento do Fab αTT do tipo selvagem, acreditamos que uma fração dos Fabs secretada por E. coli esteja em uma forma não funcional ou com problemas de dobramento. Essa interpretação está bem correlacionada com o fato de que o domínio V_L isolado, quando secretado de E. coli, estava em uma conformação muito diferente do V_L expresso no ambiente citosólico oxidante de BL21trxB(DE3) (resultados não mostrados). Isso também explica a variação funcional observada entre produções em lote do Fab.

Fig 4. Gráfico comparando o T_m de cada Fab em relação à concentração do ponto intermediário de cada curva de ligação ELISA funcional sigmoide do Fab. Reimpresso de (2) com permissão da Oxford University Press.

Resumo

Foram medidos os perfis de desdobramento térmico de 18 anticorpos humanos ou humanizados utilizando DSC, identificando-se uma ampla faixa de estabilidades do Fab. Por meio do design consensual, conduzimos uma mutagênese de saturação de um Fab particularmente instável para produzir estabilidade. A seleção de bibliotecas do Fab utilizando uma análise de desafios térmicos resultou na descoberta de 19 mutações estabilizantes em 11 locais do Fab. A combinação de mutações estabilizantes gerou aumentos na estabilidade térmica (até 92 ºC), maior expressão bacteriana e uma redução significativa no nível de material dobrado incorretamente ou não funcional. A DSC determina rapidamente os fatores que contribuem para a estabilidade do anticorpo, e é uma técnica indicadora de estabilidade valiosa que pode ser aplicada a todo o desenvolvimento bioterapêutico.

Agradecimento

Essa nota de aplicação foi autorizada por Stephen J Demarest, Ellen Garber, Gang Chen, Bruce E. Kimmel, David Gustafson, Jane Wu, Jared Salbato, John Poland, Marikka Elia, Xuqiu Tan, Ken Wong, Jay M. Short, e Geneviève Hansen no Biogen Idec, San Diego, CA, EUA.

Referências

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2. Demarest, S. J. et al. Engineering stability into Escherichia coli secreted Fabs leads to increased functional expression. Protein Engng. Des. Select. 19, 325-336 (2006).
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