Dans cette note technique, nous expliquons comment le Creoptix WAVE peut être utilisé pour comprendre la dynamique de liaison des candidats Sybody® au domaine de liaison au récepteur (RBD) du SARS-CoV-2, tous deux fournis par Linkster Therapeutics AG et l'université de Zurich. Grâce à sa sensibilité élevée et à sa technologie microfluidique fiable, le Creoptix WAVE est adapté aux dosages par compétition, à la confirmation et à l'enrichissement des données ELISA. En fournissant une caractérisation cinétique rapide pour les dosages d'inhibition, avec de l'ACE2 gracieusement fournie par leadXpro, le WAVE accélère la mise au point de traitements contre le SARS-CoV-2.
Contrairement aux médicaments traditionnels à petites molécules, qui existent généralement sous la forme d'une seule entité chimique, les produits biologiques comme les anticorps, les nanocorps et d'autres grosses molécules fabriquées dans des systèmes vivants sont très complexes. Cela rend leur caractérisation difficile, d'autant plus que de nombreux médicaments biologiques existent sous forme de multiples variantes, dont la nature et l'abondance sont fortement influencées par le processus de fabrication. Dans le contexte actuel de la pandémie de coronavirus, les anticorps synthétiques à domaine unique (également connus sous le nom de nanocorps ou Sybody) pourraient être essentiels à la mise au point de traitements préventifs contre la COVID-19, étant donné qu'ils peuvent être administrés par voie pulmonaire sous forme de formulations de nanocorps inhalées.1
L'affinité de liaison est sans doute l'une des propriétés les plus étudiées d'un produit biologique, comme une molécule de Sybody. Cependant, si elle n'est pas évaluée en parallèle avec d'autres qualités du médicament, l'affinité de liaison ne peut pas fournir suffisamment d'informations pour prédire l'efficacité clinique. La caractérisation complète dans le développement de médicaments biologiques devrait également inclure l'analyse en temps réel de la cinétique de liaison par une mesure précise des taux d'association et de dissociation pour l'interaction anticorps-cible.
Grâce à une technologie microfluidique sans obstruction et à une sensibilité supérieure aux technologies classiques de résonance plasmonique de surface (SPR) pour une mesure plus précise de l'affinité de liaison et de la cinétique de liaison, nous expliquons dans cette note technique comment le Creoptix WAVE favorise le développement de produits biologiques en fournissant des informations sur les affinités de liaison et la sélectivité des candidats Sybody pour la région du domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine de pointe du SARS-CoV-2.
Le RBD-vYFP biotinylé a été capturé sur une WAVEchip PCP-STA de streptavidine (surface presque plane de polycarboxylate ; Creoptix AG) à une densité de 1 000 pg/mm2. L'ACE2 a ensuite été injectée à des concentrations croissantes allant de 6,25 nM à 400 nM (dilution en série deux fois, 7 concentrations) dans un tampon TBS complété de Tween-20 à 0,05 % (TBST). L'ACE2 a été injectée pendant 360 s à un débit de 15 μl/min par canal et la dissociation a été réglée sur 1 200 s pour permettre le retour à la ligne de base. Les sensorgrammes ont été enregistrés à 25 °C et les données analysées sur le WAVEcontrol. Les données ont été doublement référencées en soustrayant les signaux des injections à blanc et du canal de référence. Un modèle de Langmuir 1:1 a été utilisé pour l'ajustement des données (voir figure 1).
Une sélection de Sybody (500 nM dans du TBST) seul, d'ACE2 (250 nM dans du TBST) seule ou d'un mélange de Sybody (500 nM) et d'ACE2 (250 nM) a été injectée pendant 300 s et la dissociation a été définie à chaque fois sur 1 200 s pour assurer le retour à la ligne de base. Les sensorgrammes ont été enregistrés à 25 °C et les données superposées à l'aide du WAVEcontrol après double référencement en soustrayant les signaux des injections à blanc et du canal de référence.
![[Figure 1 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg] Figure 1 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg](https://p3.aprimocdn.net/malvernpanalytical/fcc9611c-516f-4b31-ae6c-ae4000a09d7a/Figure%201%20TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD_Original%20file.jpg)
Figure 1 : cinétique de liaison de l'ACE2 purifiée sur le RBD biotinylé de la protéine de pointe
Notre collaboration a débuté par la réception de 57 candidats Sybody uniques et au bon comportement, créés par Linkster Therapeutics AG et le Pr Markus SEEGER (Institut de microbiologie médicale, université de Zurich) à l'aide de la plateforme Sybody.2 Tous les candidats Sybody ont donc été soumis à un criblage du taux de dissociation sur le Creoptix WAVE, qui a permis d'identifier six liants forts au RBD de la protéine de pointe. En accord avec les données ELISA, tout en fournissant des taux d'association et de dissociation pour plus de détails cinétiques, les constantes de liaison ont ensuite été déterminées, ce qui a révélé des affinités comprises entre 20 et 180 nM.3 Compte tenu de leurs propriétés de liaison étroite, avec des affinités situées dans la même gamme que celle de l'interaction ACE2 / protéine de pointe, nous avons décidé de caractériser davantage six candidats Sybody et d'étudier leur capacité à se disputer la liaison de l'ACE2 au RBD de la protéine de pointe.
Les candidats Sybody se disputent la liaison de l'ACE2 au RBD de la protéine de pointe. Comme la virulence du SARS-CoV-2 nécessite la liaison du RBD viral de la protéine de pointe à l'ACE2 humaine, nous avons évalué la capacité de certains candidats Sybody à inhiber la liaison de l'ACE2 au RBD de la protéine de pointe, lors de leur co-injection.
Une WAVEchip PCP-STA de stretavidine a été utilisée pour capturer le RBD biotinylé de la protéine de pointe, et des candidats Sybody et de l'ACE2 purifiée ont été injectés, soit seuls, soit en combinaison, aux concentrations indiquées. Comme le montre la figure 2E, la liaison de l'ACE2 au RBD de la protéine de pointe a été presque complètement supprimée en présence du Sybody 16, ce qui démontre un niveau d'inhibition exceptionnellement élevé de l'interaction entre l'ACE2 et la protéine de pointe. Cette inhibition est partielle en présence du Sybody 3 ou du Sybody 42 (figures 2C et 2D, respectivement) et totalement inefficace avec le Sybody 67 (figure 2B). Ces données de GCI sont conformes aux résultats ELISA précédemment rapportés (figure 2E), avec l'avantage de permettre une caractérisation plus rapide de ce dosage d'inhibition. Les preuves recueillies à l'aide de ces types de dosages analytiques appuient l'observation selon laquelle les candidats Sybody 3, 16 et 42 reconnaissent une région de surface sur le RBD de la protéine de pointe qui chevauche le site de liaison de l'ACE2.
![[Figure 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg] Figure 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg](https://p3.aprimocdn.net/malvernpanalytical/ed6bb461-28e0-4b0d-b6b4-ae4000a09ea1/Figure%202%20TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD_Original%20file.jpg)
Figure 2 : les candidats Sybody se disputent la liaison de l'ACE2 au RBD de la protéine de pointe
En résumé, dans cette note technique, nous expliquons que le Creoptix WAVE a permis de caractériser rapidement des candidats provenant des bibliothèques Sybody précédemment publiées, en plus de confirmer les connaissances sur la façon dont ces candidats Sybody inhibent l'interaction entre l'ACE2 et la protéine de pointe.3 En fournissant une validation rapide et orthogonale des données ELISA, le Creoptix WAVE est idéal pour prendre de l'avance dans la course à la compréhension de la pandémie de COVID-19, en accélérant la mise au point de traitements contre le SARS-CoV-2.
Appréhendez la dynamique de liaison pour la mise au point de traitements et générez de nouvelles données pour renforcer vos résultats et vos publications avec le Creoptix WAVE :
Idéal pour :
La protéine RBD biotinylée de la protéine de pointe du SARS-CoV-2, fusionnée à Venus YFP (RBD-vYFP), et les candidats Sybody ont été gracieusement fournis par le Pr Markus SEEGER (IMM, Zurich) et Linkster Therapeutics AG. L'ectodomaine purifié et marqué à l'histidine de l'enzyme humaine de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) a été généreusement fourni par le Dr Matthieu BOTTE (leadXpro).
