La mayoría de los productos bioterapéuticos son proteínas o derivados de proteínas y la única clase más grande de productos biofarmacéuticos que se encuentra actualmente en el mercado o en desarrollo son los anticuerpos monoclonales (mAbs, por sus siglas en inglés). La naturaleza de enlace específica de los anticuerpos ha otorgado la oportunidad de que la industria biofarmacéutica los utilice para modular la actividad de moléculas objetivo relevantes desde el punto de vista farmacéutico con el fin de controlar o prevenir una enfermedad.
Una diferencia clave entre los medicamentos de pequeñas moléculas tradicionales y los medicamentos biofarmacéuticos es que estos últimos se deben procesar y entregar en forma líquida. Las proteínas son notoriamente inestables en solución, por lo que se deben desarrollar enfoques a través de los cuales estas moléculas bioterapéuticas se puedan fabricar y almacenar por largos períodos en solución sin que se degraden. En este sentido, los ensayos de estabilidad de proteínas han resultado ser muy valiosos en el desarrollo y la fabricación de medicamentos bioterapéuticos.
Evidentemente, los ensayos de estabilidad en tiempo real deben evaluar la longevidad o la vida útil de una proteína en solución. Sin embargo, estos ensayos requieren mucho tiempo, por lo que se han establecido métodos predictivos más rápidos para acelerar el proceso de conocimiento y que permitan desarrollar formulaciones y condiciones de proceso de medicamentos biológicos estables.
Los más comunes dentro de estos enfoques predictivos son los métodos de despliegue térmico, que monitorean las propiedades físicas de las proteínas en un función de la temperatura. Con estos datos, las temperaturas en que las proteínas sufren cambios conformacionales se pueden determinar y utilizar para estudios comparativos. Se supone que las moléculas que requieren temperaturas más altas para sufrir cambios conformacionales tienen una vida útil más larga o son más estables. Sin embargo, existen algunas excepciones importantes a esto que se explicarán más adelante en este documento.
Los perfiles de despliegue o estabilidad térmica se pueden obtener para diferentes candidatos para medicamentos en la misma solución amortiguadora, de manera que se pueda comparar la estabilidad intrínseca de potenciales medicamentos bioterapéuticos en un conjunto determinado de condiciones. Esta aplicación se conoce como "selección de candidatos".
Los perfiles de estabilidad térmica se pueden generar para cualquier molécula candidata en una gama de soluciones amortiguadoras y cosolutos con el fin de ayudar a identificar las condiciones estabilizadoras o desestabilizadoras. Entre los aditivos o excipientes de formulación típicos se encuentran aminoácidos, azúcares, polioles, sales y detergentes. Se debe tener cuidado para garantizar que estas sustancias no interfieran en el ensayo. Estos tipos de pruebas habitualmente son realizadas por grupos de desarrollo de preformulaciones/formulaciones y procesos. Este último objetivo apunta a identificar las estrategias de purificación que maximizarán el rendimiento del medicamento bioterapéutico por medio de la identificación de la carga estable y soluciones amortiguadoras de elución para los procesos cromatográficos y para la optimización de los pasos de inactivación viral.
Las más cuantitativas de estas tecnologías de análisis, como la calorimetría de barrido diferencial (DSC, por sus siglas en inglés), también se utilizan para estudios de biosimilitud y comparabilidad.
Como se indicó anteriormente, se supone que las moléculas que parecen necesitar temperaturas más altas para sufrir cambios conformacionales tendrán una vida útil más prolongada. Sin embargo, esta "regla general" puede ser engañosa si la técnica seleccionada para monitorear estos cambios no detecta ciertos eventos conformacionales o procesos de inactivación química. Por esta razón, se debe tener especial consideración cuando realice la compra de su próxima plataforma para ensayos de estabilidad de proteínas.
Existen varias tecnologías en el mercado para medir la estabilidad de las proteínas. Muchos fabricantes demuestran la calidad de los datos que generan estos instrumentos mediante la comparación de resultados con aquellos obtenidos con la calorimetría de barrido diferencial (DSC). La DSC es el estándar mediante el cual miden sus tecnologías y muestra el gran valor que se otorga a los datos generados con DSC en la comunidad biofísica. Por esta razón, con frecuencia se llama "estándar de referencia" a la DSC.
Una cita de uno de nuestros clientes destaca la utilidad de la DSC:
"La DSC es probablemente el método más fuerte, informativo y relevante de todos los métodos biofísicos disponibles en la actualidad".
Sorina Morar-Mitrica, Ph.D - GlaxoSmithKline; The BioProcessing Summit, 2012
Si bien siempre es posible encontrar ejemplos donde estas tecnologías alternativas en realidad generan buenos datos, se debe admitir que existen muchas instancias donde se prueba que son menos útiles. Por razones obvias, estos ejemplos raramente se publican.
Todos los proveedores utilizan su propia jerga y tienen diferentes formas de presentar sus instrumentos y especificaciones. Sin embargo, todas las consideraciones acerca de los instrumentos que se pueden usar para medir la estabilidad de las proteínas deben comenzar con un entendimiento de los requisitos de aplicación particulares y cómo las especificaciones y las características del producto afectan estos requerimientos.
La mayoría de los proveedores de tecnologías no calorimétricas para la estabilidad de proteínas sitúan directamente sus productos en relación con la DSC. Si bien algunos de estos productos tienen ventajas específicas en términos de menor consumo de muestras por ejecución, esto es en perjuicio de la reproducibilidad y el contenido de la información. No es una ventaja ahorrar muestras cuando los datos generados pueden ser confusos y llevan a tomar una mala decisión. La repetición de partes importantes del proyecto de desarrollo debido a datos ambiguos de estabilidad de proteínas tiene un costo muy alto.
1.¿Deseo poder usar el instrumento para evaluar la estabilidad de todas las proteínas o de todos los candidatos bioterapéuticos?
La DSC se puede aplicar al análisis de todas las proteínas, independientemente del número o la posición de los residuos triptófanos presentes.
Otras tecnologías que miden la fluorescencia intrínseca son solo ensayos indirectos de la estabilidad de las proteínas. Lo que realmente miden es el cambio en la polaridad del entorno de un residuo triptófano a medida que se despliega una proteína.
Hay varios problemas con este enfoque. El cambio en el entorno de este residuo de aminoácido en particular necesita ser representativo del despliegue de la molécula completa. Es decir, el residuo triptófano debe enterrarse en el núcleo de la proteína y también debe estar presente en todos los dominios de una proteína multidominio. Efectivamente, es probable que no sea el caso. La estabilidad estructural de un subdominio que no incluye un residuo triptófano no será evaluada, lo que podría dar como resultado una formulación o selección de candidato incorrecta. Esto podría afectar al próximo departamento en el proceso de desarrollo. Algunas proteínas ni siquiera incluyen residuos triptófanos y, por esta razón, no se pueden analizar en absoluto mediante el uso de métodos de fluorescencia intrínseca.
Figura 1: Termogramas de DSC para un candidato biológico Estos datos muestran el despliegue térmico de un anticuerpo en diferentes soluciones amortiguadoras. Los perfiles muestran diferentes picos adyacentes que representan el despliegue de las regiones CH2, CH3 y el fragmento de unión a los antígenos (Fab, por sus siglas en inglés) del anticuerpo. Las condiciones de formulación usadas en el panel inferior se seleccionaron para su uso debido a su TM más alto y su T1/2 más bajo.
2.¿Deseo poder caracterizar la estabilidad de todos los dominios individuales en una proteína multidominio?
Debido a la alta reproducibilidad de la DSC y su capacidad de monitorear cambios estructurales en toda la proteína, se puede usar para medir de manera clara la estabilidad de subdominios individuales. Hay ejemplos de técnicas espectroscópicas que generan perfiles de estabilidad de proteínas que contienen información acerca de dominios, pero también existen muchas instancias donde no pueden entregar estos datos ni detectar ciertos cambios estructurales. Esto se debe a que los residuos triptófanos no están distribuidos en toda la proteína de una forma ideal para la detección de fluorescencia. Algunos dominios tendrán residuos triptófanos enterrados y algunos no. Esto es quizás particularmente importante si un instrumento no puede detectar la primera transición y, así, selecciona de manera incorrecta un candidato o solución amortiguadora de formulación porque la proteína sufrió cambios estructurales que no fueron visibles para la técnica empleada para medirlos. La DSC es una técnica genérica, global y de alta resolución para medir la estabilidad de las proteínas y no presenta estos tipos de problemas.
Figura 2: Despliegue térmico de un anticuerpo observado con la detección de fluorescencia intrínseca. El perfil no tiene una transición marcada y, por esta razón, no fue óptima para la determinación del TM
Otra ventaja del uso de DSC para monitorear la estabilidad de los subdominios de anticuerpos es que el tamaño del dominio del enlace de Fab es típicamente más grande que el de los dominios CH2 y CH3, lo que hace más sencilla la identificación. La amplitud de la señal para la mayoría de las técnicas espectroscópicas no es específica del dominio. Por esta razón, es fundamental conocer qué dominio se estabiliza o desestabiliza. Esto es particularmente importante para los proyectos de ingeniería de proteínas y la selección de candidatos, donde es vital entender qué parte del producto biológico se ve afectada.
3.¿Deseo que los datos estén libres de errores experimentales que puedan afectar los resultados?
Muchos métodos con bajo consumo de muestras usan la fluorescencia como una medición indirecta de la estabilidad de las proteínas. Además de los problemas descritos anteriormente, la fluorescencia presenta ciertos errores, específicamente, desactivación, filtrado interno, agregación y dispersión de luz, que generalmente cambian en función de la concentración de la muestra. Esto tiene dos consecuencias importantes. La primera es que es muy difícil obtener datos reproducibles al comparar datos en días diferentes y en laboratorios distintos, ya que es complicado y requiere mucho tiempo asegurar que todos los cosolutos están en concentraciones idénticas. La segunda consecuencia es que estos artefactos pueden impactar en la forma de las curvas de despliegue, lo cual hace que el análisis sea diferente de una ejecución a otra, sea extremadamente subjetivo y que necesite un amplio conocimiento para interpretarlo correctamente.
Algunos ensayos espectroscópicos de estabilidad de proteínas requieren el uso de colorantes para monitorear la estabilidad de la proteína. Estos ensayos tienen los mismos problemas que la fluorescencia intrínseca, pero, además, el colorante puede afectar la estabilidad de la proteína en sí, o un componente de la solución amortiguadora puede afectar el grado de interacción del colorante con la proteína. Esto puede dar como resultado perfiles de estabilidad que reflejen la interacción del colorante con la proteína, complicada además por la interferencia de un componente de la solución amortiguadora, lo que tiene poca relación con la estabilidad de la proteína en sí. Esto también es válido para las aplicaciones donde los perfiles de estabilidad se usan como un método indirecto para realizar pruebas de enlace de moléculas pequeñas para potenciales objetivos de medicamento.
El hecho de que la DSC sea una técnica de primer recurso que mide la estabilidad de una proteína completa, una técnica verdaderamente global, significa que no sufre de las limitaciones mencionadas anteriormente.
4.¿Deseo obtener datos reproducibles?
La DSC se suele llamar el "estándar de referencia" de los ensayos de estabilidad de proteínas debido a que produce datos altamente reproducibles. Por esta razón, la DSC se utiliza para estudios de biosimilitud y biocomparabilidad. La DSC fue una tecnología clave en una aplicación reciente y exitosa para la aprobación de un medicamento bioterapéutico, Remsima, un producto biosimilar a Remicade. Otro ejemplo es el trabajo de un grupo, luego en Amgen, que encontró que la DSC fue la mejor técnica para identificar un producto bioterapéutico que se había oxidado. La razón detrás del éxito de esta aplicación fue la alta reproducibilidad de los datos de la DSC y el hecho de que la DSC puede detectar incluso cambios sutiles en la estructura de orden superior de una proteína multidominio.
También se está investigando la utilidad de la DSC como una herramienta de diagnóstico para identificar pacientes con diversas formas de cáncer. Indudablemente, la reproducibilidad de la DSC es fundamental para esta aplicación. A continuación se presenta una cita de un científico que lideró el equipo que realizó este trabajo, quien destaca la alta reproducibilidad de los datos de DSC que se obtuvieron usando MicroCal VP-Capillary DSC de Malvern:
"Es especialmente apropiada para analizar de manera autónoma conjuntos grandes de muestras y para minimizar los errores humanos o accidentales".
"Se caracteriza por una excelente reproducibilidad de barrido y una sensibilidad impresionante para reducir el uso de muestras".
"Es fácil de programar con el software de control".
"Es fácil realizar el mantenimiento y conservarlo en una condición apropiada por medio de la programación de barridos de limpieza/control periódicos".
Adrian Velazquez-Campoy - Instituto BIFI - Universidad de Zaragoza, España
5.¿Deseo medir la estabilidad de mi muestra biológica en una gama amplia de soluciones amortiguadoras o cosolutos?
Algunas tecnologías tienen requerimientos muy específicos para soluciones amortiguadoras o cosolutos compatibles. El dicroísmo circular es un buen ejemplo de esta limitación, ya que algunas soluciones amortiguadoras, como las que se emplean en estudios de formulación, absorben luz a la misma longitud de onda que la proteína, lo que provoca la saturación de la señal. Además de esto, incluso el uso de cantidades muy pequeñas de detergentes, un componente común de las soluciones amortiguadoras de formulaciones, es incompatible con la mayoría de las tecnologías basadas en fluorescencia.
La DSC es una técnica no espectroscópica y no se ve afectada por estos problemas.
6.¿Necesito caracterizar proteínas con una estabilidad térmica alta?
La DSC está específicamente diseñada para adaptarse y medir una amplia gama de estabilidades térmicas de proteínas y se ha diseñado para trabajar a temperaturas altas e inferiores a la del ambiente. En contraste, normalmente las técnicas espectroscópicas no se pueden utilizar bajo 20 °C o sobre 90 °C. Habitualmente, el inicio de la desnaturalización térmica de proteínas térmicamente volubles se producirá bajo la temperatura ambiente y es fácilmente omitido por las técnicas espectroscópicas. En el otro extremo del espectro, aunque muchas proteínas tienen un TM o punto medio de transición térmica inferior a 90 °C, normalmente se necesita una temperatura 20 °C mayor para determinar el punto final de manera precisa.
Esto significa que se necesita emplear la DSC si el TM es ~70 °C para cualquiera de las proteínas.
7.¿Deseo tener datos que sean sencillos para el análisis?
MicroCal VP-Capillary DSC de Malvern utiliza un software de análisis automático, lo que elimina la subjetividad y reduce la necesidad de tener un amplio conocimiento. Los resultados obtenidos de muchas tecnologías en competencia pueden ser muy subjetivos y difíciles de analizar. Esto es particularmente evidente cuando se analizan proteínas multidominio como los anticuerpos.
"El alto rendimiento está respaldado por el software de análisis, que es fácil de usar y ya no requiere de cálculos manuales y, por esta razón, permite ahorrar horas de trabajo. Este ahorro de tiempo realmente ha mejorado nuestro flujo de trabajo".
Katherine Bowers - Fujifilm Diosynth Biotechnologies
8.¿Deseo detectar cambios sutiles en la estabilidad de las proteínas?
La DSC puede detectar cambios en todos los niveles de la estructura de las proteínas (primaria, secundaria, terciaria y secundaria) Y es extremadamente reproducible. Esto significa que la DSC detectará incluso cambios muy pequeños en el TM y, por ende, en la estructura de orden superior (HOS, por sus siglas en inglés).
Un ejemplo reciente mostró que el termograma de DSC de una proteína multidominio fue el mejor enfoque para detectar niveles bajos no deseados (<5 %) de productos bioterapéuticos oxidados al compararlo con una amplia gama de técnicas espectroscópicas (Arthur et al, (2015) J Pharm Sci, Volumen 104, 1548–1554).
9.¿Qué tan bueno es el fabricante o proveedor?
Es importante evaluar la reputación del fabricante o proveedor que vaya a utilizar con el fin de garantizar que está invirtiendo en un producto de calidad.
Los instrumentos de DSC se deben fabricar empleando altos estándares y su construcción debe estar en manos de empresas sólidas con tecnología de punta para brindar resultados con calidad para publicación o para tomar decisiones.
Elija un fabricante con una trayectoria apropiada a la vanguardia del desarrollo y la optimización de estas tecnologías. Estas empresas producen instrumentos con una buena variabilidad de máquina a máquina y, por lo general, son las primeras en desarrollar avances innovadores para esta tecnología y sus aplicaciones. Es más probable que estas empresas tengan el conocimiento, la experiencia y los recursos de soporte no solo para construir excelentes instrumentos, sino también para brindar la asistencia adecuada para ellos.
10.¿Qué hay del servicio de posventa y el soporte?
La compra de un instrumento es solo el comienzo de una larga relación con el proveedor o fabricante, por lo que es importante comprar un sistema de una empresa que ofrezca una asistencia de posventa y un servicio apropiados.
Escoja una empresa que pueda brindar asistencia telefónica, presencial y por correo electrónico, oportunidades de capacitación continua, un servicio en terreno y asistencia a nivel de expertos. Antes de comprar un instrumento, consulte que asistencia se ofrece, de modo que pueda conocer la calidad y el alcance de la asistencia que puede esperar una vez que tenga el nuevo instrumento instalado en su laboratorio.
Aplicación/Requisito | MicroCal DSC | Dicroísmo circular | Fluorescenciaintrínseca | Fluorescenciaextrínseca |
Genérico para todas las proteínas | Sí | Sí | No | No |
Sensible a todos los niveles de estructura de las proteínas | Sí | No | No | No |
Lectura cuantitativa directamente proporcional a la cantidad de material plegado | Sí | Sí | No | No |
Ensayo de estabilidad de proteínas global y de alta resolución | Sí | No | No | No |
Múltiples métricas para la estabilidad de proteínas | Sí | No | No | No |
Naturaleza de la huella molecular del perfil de despliegue | Sí | No | No | No |
Libre de errores ópticos | Sí | No | No | No |
Altamente reproducible | Sí | No | No | No |
No se necesitan colorantes, etiquetas o aditivos químicos | Sí | Sí | Sí | No |
Libre de interferencia de soluciones amortiguadoras y cosolutos | Sí | No | No | No |
Mide el TM sobre 70 °C | Sí | No | No | No |
Mediciones de estándar de referencia del TM | Sí | No | No | No |
La tabla anterior ilustra con claridad por qué la DSC se utiliza en toda la industria biofarmacéutica y se considera el "estándar de referencia" para la medición de la estabilidad de proteínas. Esta afirmación está respalda por un artículo reciente que detalla las reacciones de un número de profesionales en la industria cuando se les solicitó clasificar la utilidad de las tecnologías para aplicaciones clave en el proceso de desarrollo biofarmacéutico (Gabrielson and Weiss IV [2015], Journal of Pharmaceutical Sciences 104:1240–1245). Las aplicaciones van desde la selección de candidatos y el desarrollo de formulaciones hasta la comparabilidad y la biosimilitud.
Es evidente que la DSC es la técnica más apropiada a nivel universal para evaluar la estabilidad de un medicamento biológico.
Si bien algunas técnicas no espectroscópicas consumen menos muestras que la DSC, a veces son simplemente inapropiadas para esta aplicación debido a las debilidades inherentes, que incluyen (pero no se limitan a) la interferencia de colorantes, dispersión, filtrado interno, señal baja o inexistente e información estructural mal definida de los subdominios.
Muchos de estos resultados e incompatibilidades pueden dar como resultado decisiones deficientes de alto costo, que pueden llevar a proyectos de repetición del desarrollo o a la incapacidad de desarrollo de un medicamento biológico.
MicroCal DSC de Malvern ofrece datos reproducibles, libres de errores y con estándar de referencia para cualquier proteína en cualquier solución amortiguadora.
