¿Cómo puedo confiar en mis datos? ¿Afecta la tecnología de medida de alguna manera a los datos? o alternativamente ¿Afecta el operario durante la preparación de muestras o los parámetros de análisis empleados? Para responder a estas preguntas, necesitamos considerar el uso de técnicas de medida independientes y complementarias con el objetivo de proporcionar confianza y validación de las medidas. Dos técnicas complementarias son NTA y DLS. Esta Nota de aplicación describe ambas tecnologías y los resultados complementarios que proporcionan, mientras que además explora cómo su utilización conjunta proporciona una completa plataforma de parámetros de medida disponible para aquellos interesados en la caracterización de materiales a escala nano.
¿Cómo puedo confiar en mis datos? Esta es una preocupación común para muchos investigadores que utilizan instrumentación de medida de partículas. ¿Afecta la tecnología de medida de alguna manera a los datos? o alternativamente ¿Afecta el operario durante la preparación de muestras o los parámetros de análisis empleados? Para responder a estas preguntas, necesitamos considerar el uso de técnicas de medida independientes y complementarias con el objetivo de proporcionar confianza y validación de las medidas.
Dos técnicas complementarias son NTA y DLS. Esta Nota de aplicación describe ambas tecnologías y los resultados complementarios que proporcionan, mientras que además explora como su utilización conjunta proporciona una completa plataforma de parámetros de medida disponible para aquellos interesados en la caracterización de materiales a escala nano.
Es una técnica de alta resolución que analiza partículas individuales y visualiza la luz dispersada por las nanopartículas en suspensión líquida Consiste en un proceso en tres pasos, que comienza con la captura de un video de las partículas en movimiento, seguido de un análisis por software de su movimiento, y finalmente un análisis de datos para generar un perfil de distribución de tamaño.
Fig 1. Proceso en 3 pasos de la medida por NTA.
Mediante el seguimiento del movimiento browniano de cada partícula individual y la aplicación de la ecuación de Stokes-Einstein, puede calcularse el tamaño de partícula en un proceso partícula a partícula.
Los puntos clave de la tecnología NTA son:
La dispersión de luz dinámica se utiliza para medir el tamaño de partícula y el tamaño molecular. DLS es una técnica que al igual que NTA relaciona la difusión de las partículas bajo movimiento browniano con su tamaño de partícula. Ya que ambas técnicas se basan en el mismo principio de fondo (esto es, medida del movimiento Browniano), representan metodologías ideales para utilizarse de forma complementaria. Cada una de ellas dispone de sus parámetros únicos de medida y tienen ventajas específicas para algunas aplicaciones, pero cuando se utilizan en conjunto conforman una plataforma de medida muy poderosa.
Los puntos clave de la tecnología DLS son:
Cómo medir una muestra polidispersa constituye un desafío común en la caracterización de partículas. La heterogeneidad de la muestra en función de los tipos de material y los tamaños, junto con las diferencias en las concentraciones relativas de estas especies, representa un desafío en la caracterización. De todas formas, dadas las ventajas complementarias de las técnicas NTA y DLS, la mayor parte de las eventualidades pueden cubrirse utilizando las dos tecnologías en conjunto.
Hay dos complicaciones muy comunes que aparecen en la caracterización de muestras que contienen distintos rangos de tamaño de partícula.
La primera surge cuando el usuario desea medir una muestra que contiene una población de partículas pequeñas y a la vez también desea ver la presencia de una población menor de partículas más grandes. En muchas de estas aplicaciones, las partículas más pequeñas representan el aspecto funcional del producto o la muestra, y las partículas grandes representan una contaminación no deseada. Hay muchos ejemplos de aplicaciones donde se observa esto; por ejemplo: tintas inkjet donde los agregados pueden bloquear la boquilla del inyector; en proteínas terapéuticas los agregados pueden iniciar reacciones inmunes adversas en el paciente; en la fabricación de obleas de Silicio para semiconductores la presencia de partículas grandes en la lechada de pulido puede arañar la oblea. En todos estos ejemplos la muestra puede describirse como una población de partículas pequeñas a alta concentración con una baja cantidad de partículas más grandes.
En estos casos, El equipo Zetasizer Nano DLS es una herramienta ideal. La muestra puede medirse normalmente sin diluir, así que cualquier evento asociado a la dilución de muestra puede evitarse. En la figura 2 puede verse una muestra de hemoglobina en PBS y el efecto del calentamiento de la muestra en el grado de agregación. La figura 3 muestra la dependencia en el tiempo de la muestra a dos temperaturas distintas, demostrando la capacidad del Zetasizer Nano para monitorizar los cambios dinámicos en la agregación con el tiempo. En este ejemplo, la capacidad de analizar tendencias del Zetasizer Nano proporciona datos de forma rápida, robusta y comprensible.
Figura 2. Distribución de tamaño por DLS con datos de intensidad para hemoglobina, mostrando los cambios en el tamaño de partícula asociados con el calentamiento de la muestra de 37 a 44 ºC
Figura 3. Datos de DLS de hemoglobina mostrando los cambios en el tamaño de partícula durante el tiempo asociados por calentamiento a 41 y 44 º C.
La segunda complicación habitual aparece cuando el usuario desea medir con precisión muestras, que exhiben un amplio rango de tamaños de partículas, quizás para comprender como los diferentes tamaños afectan al comportamiento de la muestra. En estos casos, la alta resolución de la tecnología NTA y su capacidad para medir partícula a partícula se convierten en una herramienta ideal para la medida precisa del rango de partículas presentes en la muestra.
Para demostrar la resolución de NTA en un rango de tamaños, se ha preparado una muestra de prueba con una mezcla de nano esferas de referencia de 100, 200, 300 y 400 nm, como se muestra en la figura 4. Se pueden resolver perfectamente las cuatro poblaciones dentro de la muestra y por tanto se obtiene una mayor confianza a la hora de medir muestras reales con una alta polidispersidad. Esta alta resolución es uno de los puntos clave de la tecnología NTA y complementa perfectamente el rango de tamaños que se pueden medir a través de DLS.
Figura 4. Datos de distribución de tamaño de NTA Nanosight para una mezcla de esferas de referencia de 100, 200, 300 y 400 nm demostrando la alta resolución de la tecnología.
La capacidad de medir muestras en un amplio rango dinámico de concentración es de vital importancia en muchas instalaciones que pueden tener diversos usos para su instrumentación analítica. Muchas aplicaciones requieren que las muestras sean medidas en su forma original sin diluir, ya que la dilución puede causar algún cambio en las características de la muestra. Muchos equipos DLS utilizan detección de retrodispersión o backscattering para extender el límite superior de concentración. Cuando se mide a 173 º de ángulo, el láser no pasa a través de todo el conjunto de muestra, por tanto la posibilidad de tener dispersión múltiple se reduce y pueden medirse muestras más concentradas. Adicionalmente, como las partículas más grandes dispersan la luz más eficientemente en la dirección longitudinal, medir a 173 º de ángulo reduce también la perturbación que puedan ocasionar aglomerados más grandes.
El equipo Malvern Panalytical Zetasizer es el único instrumento de DLS que lleva esta capacidad un paso más allá mediante la aplicación de la tecnología Retro Dispersión No-Invasiva (NIBS Non-Invasive Back Scatter). NIBS presenta óptica móvil (se muestra el esquema en la figura 5) combinada con la medida a 173 º, dando lugar a la capacidad de alterar la longitud de paso del láser para optimizar perfectamente el análisis de muestra independientemente de la concentración y el tamaño. Con el objeto de demostrar la potencia de la tecnología NIBS, se ha medido un patrón de 200 nm a distintas concentraciones – La figura 6 muestra el tamaño de partícula medido frente a la dilución de la muestra. Esto demuestra que el Zetasizer Nano es capaz de generar una repuesta lineal entre diluciones x3 a x100.000. Esto es muy importante para usuarios que desean medir sus muestras sin diluir o para instituciones que requieren una rango muy amplio de concentraciones ya que trabajan en aplicaciones muy diversas.
Figura 5. Esquema de la posición de medida de DLS para (a) una dispersión muy débil o muestra de baja concentración y (b) muestra concentrada o de dispersión intensa.
Figura 6. Datos de DLS para muestra de referencia de poliestireno de 200 nm medida en un rango de diluciones de muestra utilizando el equipo Zetasizer Nano, mostrando una respuesta lineal en el tamaño de partícula independientemente de la dilución de la muestra.
Los equipos Nanosight incorporan la capacidad de medir el tamaño de partícula, la concentración y el potencial Z operando en modo fluorescencia, de tal forma que únicamente aquellas partículas que emitan señal de fluorescencia sean detectadas y medidas El equipo permite elegir distintas longitudes de onda de excitación ( 405, 488, 532 y 642 nm) proporcionando una alta flexibilidad a la hora de elegir el fluoróforo más adecuado.
Los usuarios pueden desear medir nanopartículas fluorescentes por dos motivos. En primer lugar, es un requisito común para comprender el destino de las nanopartículas en condiciones biológicamente relevantes. Cuando se miden por ejemplo vehículos de liberación de fármacos, es importante comprender y medir el tamaño de los vehículos para entender en qué lugar del organismo pueden acabar, que velocidad de liberación poseen y como la agregación puede afectar al rendimiento biológico. En cualquier caso, en la mayoría de los casos el tamaño de partícula se mide in vitro, apartando el análisis de las condiciones biológicas reales. El uso de la fluorescencia implica que pueden medirse los vehículos en condiciones biológicamente relevantes. Esta información se puede utilizar para ayudar a mejorar la eficiencia de un vehículo de liberación de fármacos. En la figura 7 puede verse una muestra de liposomas que han sido marcados utilizando un marcador fluorescente lipofílico y que han sido suspendidos en un medio de crecimiento FBS. Cuando se mide en modo dispersión (Figura 7A), se visualizan todos los componentes del medio y es imposible detectar específicamente y medir los liposomas de interés. En la figura 7B puede verse la misma muestra a la misma concentración, trabajando en modo de fluorescencia En modo fluorescencia, solo la luz de la emisión fluorescente es captada por la cámara y por tanto solo los liposomas fluorescentes son detectados Esto ofrece la posibilidad de medir específicamente partículas diana en medios biológicos complejos, llevando la comprensión del mecanismo de acción de los vehículos de liberación de fármacos un paso más cerca de la realidad.
Figura 7. Capturas de pantalla del equipo Nanosight, mostrando liposomas marcados fluorescentemente suspendidos en Suero Fetal Bovino, trabajando en modo dispersión (A) y en modo fluorescencia (B).
El segundo motivo donde la medida en fluorescencia añade normalmente valor es en la identificación de partículas específicas contenidas en una muestra desconocida, como es el caso de aplicaciones de diagnóstico. Aquí, pueden utilizarse anticuerpos con marcado fluorescente para unirse específicamente a antígenos en la superficie de las partículas que el usuario desea identificar dentro de una muestra que contiene diversos tipos de partículas.
En sistemas coloidales, la agregación puede ser un problema y el estudio del potencial zeta de un sistema proporciona una comprensión de la tendencia a la agregación. La mayoría de las dispersiones coloidales tienen una carga superficial originada por la naturaleza de las partículas y el medio que las rodea. La estabilidad de un sistema coloidal puede determinarse sumando las fuerzas de atracción de Van der Waals y las fuerzas de repulsión de la doble capa eléctrica. Los factores que afectan al potencial Z, incluyen el pH, la conductividad y la concentración de los componentes de la formulación, y generalmente se acepta que sistemas que tienen un potencial Z entre + 30 y -30 mV presentan una inestabilidad y que a largo plazo aparecerán agregados.
El instrumento Malvern Panalytical Zetasizer Nano utiliza microelectroforesis doppler láser para medir el potencial Z. Se aplica un campo eléctrico a una solución de moléculas o a una dispersión de partículas, que entonces se mueven con una velocidad relacionada con su potencial zeta. Esta velocidad se mide utilizando una técnica patentada interferométrica por láser denominada M3-PALS (Phase Analysis Light Scattering). Esto permite la determinación de la movilidad electroforética y a partir de ésta, el potencial Z y la distribución de potencial Z, incluso en muestras con movilidad muy baja. Un accesorio de potencial zeta de superficies utiliza partículas trazadoras para medir la electro-ósmosis cerca de la superficie de una muestra para calcular el potencial zeta de la superficie. El equipo se puede suministrar con un autotitulador, que permite al usuario estudiar los efectos de los cambios de pH o conductividad en la estabilidad de un sistema.
La capacidad de medir potencial Z en el equipo Zetasizer Nano se complementa con la habilidad de medir el potencial Zeta individual mediante NTA utilizando equipos de la gama Nanosight.. Esta última tecnología se basa en la medida de partículas individuales y esto ofrece distribuciones de potencial Z de alta resolución. Cuando se utiliza NTA, el potencial Z se determina midiendo la velocidad de una partícula en suspensión cuando se aplica un campo eléctrico (velocidad electroforética y electro osmósis). El equipo Nanosight NS500, por ejemplo, registra el cambio de velocidad para cada partícula analizada, que está compuesto por elementos de ambos tipos de movimiento. Observando la velocidad total a diferentes alturas en la cámara cerrada, y asumiendo un flujo neto nulo a través de la profundidad de la cámara, es posible separar los dos componentes. La velocidad electroforética (debida a la fuerza eléctrica sobre las partículas) puede medirse para cada partícula seguida por el NS500. Esta velocidad electroforética puede usarse entonces para calcular el potencial zeta con base en una sola partícula. NTA permite medir el potencial Z a la vez que se mide el tamaño, por tanto proporciona al usuario una caracterización de partículas multi parámetro simultánea.
Figura 8: Distribución de potencial Z partícula a partícula medida en Nanosight frente a datos de concentración de partículas (A) y tamaño de partícula frente a potencial Z (B)
Medida de concentración de partículas
Para muchos usuarios, la medida del tamaño de partícula no es la única variable importante. Para muchas aplicaciones, la concentración de partículas es crítica. El conocimiento de la concentración de virus o partículas víricas (VLPs) es fundamental para comprender la dosis de una vacuna. En aplicaciones de liberación de fármacos, el conocimiento de la concentración de los vehículos de liberación puede estar relacionado con la dosis del fármaco transportado. En aplicaciones de exosomas, la concentración de las vesículas puede ser fundamental para determinar el comienzo de una enfermedad ya que la concentración de vesículas específicas puede incrementarse mucho comparada con muestras de un paciente control. Recientemente, se han desarrollado normativas Europeas que cubren la definición y la regulación de las partículas conocidas como nanomateriales. La definición de la norma específica que aquel material que esté compuesto al menos en un 50 % de población por partículas entre 1 y 100 nm es un nanomaterial. Esta definición está basada en número, y por tanto la capacidad de contar partículas en este rango de tamaños está ganando importancia según avanzan las normativas y se identifican y regulan los nanomateriales en función de su seguridad. En todos estos casos, los equipos Nanosight proporcionan la capacidad de complementar medidas de tamaño de alta resolución junto con la capacidad para determinar la concentración en términos de partículas por mL.
Los usuarios pueden desear hacer un screening de un conjunto de muestras para determinar los efectos del cambio en algunas variables o condiciones. Esto hace que tengan que medirse un gran número de muestras y además que se midan de una forma estandarizada y reproducible para poder detectar y analizar diferencias sutiles entre muestra y muestra Esta necesidad representa un desafío para los recursos y también para la repetibilidad. Para evitar estos problemas, el equipo Zetasizer APS (Automatic Plate Sampler) ha sido diseñado Este instrumento puede medir pequeños volúmenes de muestra en placas estándar de 96 o 384 pocillos, permitiendo el análisis mediante DLS de cada muestra, tal y como se muestra en la figura 9. Pueden programarse procedimientos de operación estándar (SOP) para asegurar la repetibilidad de medidas entre muestras. El análisis de datos toma la forma de un navegador con la figura de la placa señalando cada pocillo en distintos colores (Figura 10) donde las tendencias se marcan para que los datos sean muy fáciles de interpretar.
Figura 9. Esquema del equipo Malvern Panalytical Zetasizer APS
Figura 10. Navegador de software del equipo Zetasizer APS permite el análisis de datos completos de una forma simple. Las tendencias de los datos puede ser codificados por colores para ayudar a la interpretación de los resultados
Los rangos de instrumentos Zetasizer Nano DLS y Nanosight NTA se complementan perfectamente, constituyendo una plataforma de análisis útil para muchos investigadores interesados en la caracterización de sistemas nanoparticulados y bioparticulados. Ambos equipos miden el tamaño de partícula y el potencial Z. El amplio rango de tamaño de partícula del Zetasizer Nano se complementa con la alta resolución y la tecnología partícula a partícula del Nanosight NTA. Las medidas de potencial zeta de rutina en industria que puede llevar a cabo el Zetasizer Nano se complementan con las medidas de potencial Z de alta resolución del Nanosight NTA, que además mide simultáneamente el tamaño de partícula. El equipo Zetasizer APS complementa estas medidas con la capacidad de medir distribución de tamaño de partícula en placas de 96 y 384 pocillos, permitiendo análisis de rutina y alta productividad. La tecnología NIBS implementada en el Zetasizer Nano permite la medida de muestras en un amplio rango de concentraciones de muestra, proporcionando la flexibilidad y la capacidad de medir muestras sin diluir. Adicionalmente, el Nanosight NTA tiene la capacidad de medir la concentración de muestra en aplicaciones donde la concentración de partículas puede ser importante, como en: liberación de fármacos, desarrollo de vacunas, exosomas, microvesículas. Por último, los equipos Nanosight NTA implementan la posibilidad de medir en fluorescencia, permitiendo al usuario monitorizar el destino de partículas marcadas fluorescentemente en medios biológicos, o a través de un marcado fluorescente determinar marcadores de superficie en partículas biológicas
Todas estas capacidades de medida son complementarias por naturaleza, proporcionando una información muy rica y valiosa. Los datos de una tecnología pueden ser validados y apoyados por la segunda tecnología Como todos los equipos Malvern Panalytical, los equipos vienen acompañados por el más completo equipo de expertos técnicos listos y deseosos de dar servicio a sus aplicaciones de caracterización.
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