En esta nota técnica se muestra cómo se puede utilizar el sistema de WAVE para determinar con precisión la cinética en suero. Gracias a un diseño microfluídico sin obstrucciones, se pueden realizar estudios cinéticos en condiciones que imitan el entorno nativo lo más posible, lo que permite la traducción de estos resultados a la clínica.
La cuantificación sin marcadores de interacciones moleculares en fluidos biológicos complejos, como el suero, proporciona información valiosa para guiar los estudios terapéuticos de anticuerpos. Sin embargo, estas matrices a menudo ponen a los biosensores ópticos bajo una tensión considerable, ya que varios componentes hacen que los microfluídicos se obstruyan. Esto puede provocar largos retrasos en el programa mientras se realiza el mantenimiento esencial.
Con microfluídicos innovadores y desechables, WAVE es muy resistente a las obstrucciones. Esto hace posible el análisis cinético en matrices fisiológicamente relevantes, lo que proporciona una visión superior en comparación con las tecnologías tradicionales de resonancia plasmática en superficie (SPR).
Con la medición de la interacción entre HER2 y trastuzumab en matrices que contienen diferentes concentraciones de suero, mostramos que el sistema WAVEsystem, con su tecnología microfluídica sin obstrucciones, ofrece un análisis cinético sólido de la unión de anticuerpos en los biofluidos.
En un WAVEchip 4PCP, la fusión HER2-Fc (Sino Biological, CN) se inmovilizó en un canal a 975 pg/mm2 mediante acoplamiento amino, seguido de pasivación BSA (Roche, CH) en todos los canales para alcanzar 4200 pg/mm2 de proteína total por canal. El tampón de ejecución (RB) utilizado en todos los experimentos fue (HBS-EP+ complementado con BSA al 0,5 %). Se inyectó trastuzumab (anticuerpo absoluto, Reino Unido) a 150 ul/min para 170 s, seguido de un paso de disociación de 300 s para el estado sérico del 0 %, trastuzumab se preparó en RB al 100 % y se diluyó a partir de 20 nm (series de diluciones 4 veces).
Para el estado sérico del 50 %, trastuzumab se preparó a partir de 100 nm en 1:1 (v/v) suero:RB. para el estado sérico del 90 %, trastuzumab se preparó a partir de 100 nm en 9:1 (v/v) suero:RB. La regeneración se logró cada vez inyectando un pulso de 50 mM NaOH, 1M NaCl. Las mediciones se ajustaron mediante calibración DMSO, doble referenciación y corrección de masa durante la evaluación.
| Datos cinéticos | Rmáx (Pg/mm2) | kactivado (M-1 .s-1) | koff (s-1) | KD (pM) | |
|---|---|---|---|---|---|
| A | 0 % Suero | 151.4 | 5.58x105 | 3,19x10-5 | 57.1 |
| B | 50% Suero | 183.5 | 2.68x105 | 9,1x10-6 | 34 |
| C | 90% Suero | 100.1 | 2.25x105 | 9,49x10-6 | 42.1 |
Tabla 1: Datos cinéticos de la interacción entre HER2 y trastuzumab en diferentes concentraciones séricas.
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Figura 1: Sensogramas de la interacción entre HER2 y trastuzumab en diferentes matrices
