El novedoso ensayo cinético waveRAPID supera los límites en el descubrimiento de hits farmacéuticos

Resumen

Las campañas de cribado de alto rendimiento para el descubrimiento de fármacos de miles de compuestos pueden producir un gran número de hits que muestran una posible interacción con el objetivo del fármaco. Las afinidades de unión se pueden derivar de análisis en estado estacionario de muchos ensayos de alto rendimiento. Para la selección de aquellos hits con potencial de desarrollo, se requiere una caracterización completa de la cinética de unión. Esto identifica compuestos que aportan específicamente al objetivo deseado con tasas de unión cinética favorables. En la práctica, esto significa que se deben realizar estudios cinéticos extensos en un gran número de compuestos hit de cribado. Hasta la fecha, se trata de una empresa que consume mucho tiempo y material. Se deben preparar series de dilución adecuadas a partir de cientos de compuestos hit y se debe inyectar cada concentración en repeticiones. Creoptix ha desarrollado una tecnología novedosa que puede hacer que estos proyectos sean mucho más eficientes, permitiendo una caracterización cinética robusta de una muestra a una sola concentración. Creoptix waveRAPID en Creoptix WAVE representa un cambio de paradigma para las mediciones cinéticas en un entorno de cribado.

En el estudio actual, realizado por un grupo de descubrimiento de fármacos para HTS de nuestro cliente Idorsia Pharmaceuticals Ltd., demostramos el poder de waveRAPID en la optimización de la caracterización cinética de un gran número de compuestos hit de fármacos. En varios experimentos, se determinó la cinética de unión de hasta 146 compuestos hit mediante waveRAPID, mediante inyecciones pulsadas de muestras a una única concentración sobre el objetivo del fármaco inmovilizado previamente en la matriz del sensor. Todos los compuestos analizados se habían estudiado antes con instrumentos SPR de última generación, utilizando mediciones cinéticas tradicionales de varios ciclos. 

La comparación de los datos obtenidos de las dos tecnologías reveló una excelente correlación para las constantes de disociación calculadas (K_D) con solo unos pocos valores atípicos. Este hallazgo valida la tecnología waveRAPID en Creoptix WAVE para la aplicación en el descubrimiento temprano de fármacos, permitiendo la generación de datos cinéticos profundos en una configuración de cribado con alto rendimiento. Dado que el tiempo de caracterización de cada compuesto se reduce a solo unos minutos, se puede lograr un ahorro significativo de tiempo y materiales. Se pueden llevar a cabo grandes campañas para determinar la cinética de unión de cientos de compuestos en días en lugar de semanas, en comparación con los actuales instrumentos SPR de última generación. 

Además, la tecnología waveRAPID generó datos sólidos incluso para compuestos difíciles (como aquellos que muestran una contribución de índice de refracción volumétrico o disociación lenta) durante toda la serie de ensayos. Tales compuestos a menudo requieren regeneración superficial y reinmovilización de la proteína del ligando. Esto interrumpe el flujo de trabajo durante las campañas de medición más grandes que utilizan ensayos multiciclo tradicionales. Por último, Creoptix WAVE, así como el novedoso método waveRAPID, permiten una configuración de ensayo extremadamente sencilla, ofreciendo un análisis cinético de unión completa a partir de una única concentración por muestra. Además, la cinética directa, el motor de evaluación único y novedoso de Creoptix basado en la estimación de parámetros estadísticos, ofrece un flujo de trabajo de análisis automatizado y robusto que incluye el cálculo de errores estadísticos reales. La tecnología waveRAPID y el motor de evaluación automatizada de cinética directa representan un potente paquete que tiene el potencial de transformar la forma en que se realizan los ensayos de unión cinética en los primeros descubrimientos de fármacos actuales.

Materiales y métodos

Protocolo Creoptix

La proteína diana 1 marcada con histidina y la proteína diana 2 marcada con histidina se capturaron a una densidad de 4000 a 5000 pg/mm² en un WAVEchip 4PCP-NTA previamente cargado con iones Ni²⁺. Se realizaron inyecciones de compuestos por waveRAPID pulsada a partir de una solución de muestra de 10 μm durante 25 s, seguidas de una inyección de tampón durante 250 s con un rae de flujo de 32,5 μl/min por celda de flujo. Todas las mediciones se realizaron en tampón fosfato de 50 mM con Tween-20 al 0,05 % y DMSO al 5 %. Los datos se referenciaron por doble sustracción de la señal del canal de referencia y las inyecciones en blanco. La concentración aparente de los compuestos en el área de detección sobre los 6 pulsos de inyección se calibró con una inyección pulsada de tampón de funcionamiento suplementado con un 0,5 % adicional de DMSO, utilizando los mismos parámetros de inyección que para las muestras de compuestos. El análisis cinético se realizó mediante el motor de estimación Direct Kinetics utilizando un modelo de unión 1:1.

Protocolo de Biacore

La proteína diana 1 marcada con histidina y la proteína diana 2 marcada con histidina se capturaron a una densidad de 4000 a 5000 pg/mm² en un chip de Ni-NTA previamente activado con iones Ni²⁺. Los analitos se ajustaron a la concentración deseada mediante una dilución en serie en un tampón de análisis (50 mM de tampón fosfato con Tween-20 al 0,05 % y DMSO al 5 %). Los sensores se obtuvieron con un tiempo de asociación de 100 s, un tiempo de disociación de 250 s y una velocidad de flujo de 40 μl/min. Para determinar la cinética de unión (k_on, k_off y K_d), los sensogramas obtenidos tras la doble referenciación fueron analizados por el software Biacore T200 Evaluation utilizando un modelo de unión 1:1.

Resultados

En este estudio se validó la novedosa tecnología waveRAPID para la adquisición rápida de datos de unión cinética en un entorno similar al de cribado frente a la instrumentación y metodología más avanzadas. Como se muestra en la Figura 1, los datos de unión cinética se pueden generar rápidamente para un gran número de compuestos hit de cribado mediante inyección pulsada de cada muestra a una sola concentración. Incluida la disociación del analito, cada medición tardó unos 5 minutos. Los perfiles de respuesta típicos generados por waveRAPID se muestran en la Figura 1, panel A y B (datos en rojo, con el modelo cinético 1:1 en negro). Los parámetros evaluados se muestran en un mapa de velocidad en el panel C (compuesto de control inyectado en todo el ensayo en el círculo negro), lo que demuestra una reproducibilidad excelente. En la Tabla 1 se enumeran los tiempos de ensayo típicos y el rendimiento de las muestras comparando un ensayo ejemplar con 384 muestras en dos objetivos. 

Figura 1: Aplicación de GCI en el Creoptix WAVEdelta para el descubrimiento y caracterización precoz de hits de fármacos utilizando la novedosa tecnología waveRAPID. La caracterización cinética completa se puede obtener a partir de compuestos inyectados a una sola concentración en un entorno de cribado con waveRAPID, lo que permite un gran ahorro de tiempo y costos en el descubrimiento precoz de los hits de fármacos.
(a) Se muestra una selección representativa de perfiles de respuesta de WaveRAPID de un cribado de 80 compuestos.
(b) Utilizando ajustes de inyección personalizados de los ajustes predefinidos seleccionables en WAVEcontrol, se puede cubrir toda la gama de afinidades. Aquí, se utilizaron los ajustes para los aglutinantes intermedios (inyección pulsada de 20 segundos, disociación de 250 segundos), lo que permite la resolución de afinidades desde nanomolares bajos hasta micromolares bajos.
(c) Las tasas cinéticas se muestran en un mapa de tasas con afinidades idénticas en las líneas diagonales. Los puntos de datos del círculo muestran la excelente reproducibilidad del compuesto de control en todo el ensayo.

Tabla 1: Tiempos de ejecución de ensayos y rendimiento de muestras ejemplares comparando waveRAPID en el WAVEdelta con tecnologías de última generación (Biacore T200, 8k) para una caracterización cinética completa de 384 muestras en 2 objetivos.

Los datos cinéticos obtenidos se filtraron en busca de errores en las tasas de unión (por debajo del 100 % de la k_a absoluta y por debajo del 50 % de la k_d absoluta) y se compararon con los datos de las mediciones de múltiples ciclos SPR estándar. Como se muestra en la Figura 2, la comparación con las mediciones tradicionales de múltiples ciclos de SPR revela una correlación muy buena entre los dos conjuntos de datos. 

Figura 2: La cinética de unión del hit de cribado de fármacos medida con waveRAPID en el Creoptix WAVEdelta se traza frente a los valores obtenidos mediante mediciones cinéticas tradicionales de varios ciclos realizadas en un instrumento Biacore T200. Los datos de WaveRAPID se filtraron para detectar errores estadísticos en la tasa de asociación (k_a) por debajo del 100 % y la tasa de disociación (k_d) por debajo del 50 % del parámetro de frecuencia calculada. La correlación valida el método de cinética waveRAPID diez veces más rápido en comparación con el método tradicional.

Para desafiar aún más el sistema, se realizó otra serie de mediciones, en la que se ejecutaron compuestos más difíciles que causaban interrupciones en el flujo de trabajo y regeneración de la superficie en las mediciones tradicionales de varios ciclos durante todo el ensayo. Presumiblemente, debido al tiempo de contacto significativamente más corto del analito con la proteína diana, estas moléculas difíciles (que muestran una respuesta volumétrica alta o una disociación lenta) no interrumpen el flujo de trabajo general en WAVE y hacen innecesaria cualquier regeneración superficial intermitente. Como se muestra en la Figura 3, los parámetros de unión cinética de casi todos los compuestos de interés aún podían evaluarse de forma robusta con bajos errores y el control positivo seguía demostrando una alta reproducibilidad.

Figura 3: Treinta compuestos previamente caracterizados se midieron de nuevo en un ensayo que contenía también 30 compuestos más desafiantes que mostraban una contribución alta del índice de refracción volumétrico (RI) o disociación lenta, así como el compuesto desafiante inyectado durante el ensayo. Mientras que los complejos compuestos provocaban grandes limitaciones en el flujo de trabajo de la cinética tradicional de varios ciclos, lo que hacía necesaria la regeneración regular de la superficie, waveRAPID permitía un flujo de trabajo sin problemas con un tiempo de medición continuo sin supervisión. Los errores estadísticos en porcentaje de las constantes de asociación absoluta calculada y de tasa de disociación, determinadas por el motor de estimación de Creoptix Direct Kinetics, se trazan en el eje horizontal y vertical, respectivamente. Los compuestos que no mostraron un comportamiento difícil en ensayos anteriores (marcas verdes), así como las réplicas del compuesto de control (marcas púrpuras), se identifican claramente por los bajos errores. Además, los compuestos que presentan dificultades en ensayos anteriores debido a la gran contribución del índice de refracción volumétrico se pueden analizar de forma robusta en WAVE con errores bajos (marcas azules). El resto de compuestos difíciles de analizar se caracterizan claramente por errores mayores (marcas rojas).

Conclusiones

Con una alta sensibilidad, la capacidad de resolver interacciones extremadamente rápidas y la tecnología de ensayo waveRAPID, el sistema WAVEsystem permite la caracterización cinética de grandes cantidades de compuestos hit de fármacos en un tiempo significativamente más corto en comparación con los ensayos cinéticos de varios ciclos tradicionales. Al obtener la cinética de un solo pocillo en una inyección, se reduce el consumo de reactivo y muestra para favorecer de forma significativa el descubrimiento precoz del fármaco. Además, waveRAPID proporciona:

• Resultados comparables a los SPR tradicionales en un tiempo mucho más corto
• Tiempo de contacto reducido, conservando la proteína diana y permitiendo ensayos más prolongados e ininterrumpidos
• Alta reproducibilidad y confianza en los resultados
• Cinética de unión de una sola inyección para seleccionar hits en función de los parámetros relevantes
• Más interacciones caracterizadas en días en lugar de semanas
• Cálculo estadístico de error profundo para descubrir hits relevantes y filtrar compuestos problemáticos

Conclusiones clave

• La reducción del tiempo de contacto de la muestra preserva la integridad del objetivo para ciclos más largos
• Cinética de unión de una sola inyección
• Reproducible y comparable a las tecnologías SP tradicionales

Ideal para:

• Detección de mezclas de crudo: moléculas, fragmentos y péptidos pequeños
• Progresión rápida del cribado sistemático de candidatos prometedores
• Optimización de candidatos potenciales
• Objetivos inestables
• Compuestos difíciles
  

Reconocimientos

Agradecemos a Geoffroy Bourquin, Laksmei Goglia, Solange Meyer y Oliver Peter por llevar a cabo todos los experimentos y contribuir a este documento.