Cribado de mezclas de reacción crudas

Introducción

El cribado de fragmentos ha surgido como un potente enfoque para identificar compuestos hit iniciales en el proceso de descubrimiento de fármacos. La característica principal es que se criba un pequeño número (1000 s) de compuestos de bajo peso molecular (normalmente <250 Da) para su unión a un objetivo. El pequeño tamaño de los compuestos significa que es más probable que se unan, pero con poca afinidad y se pueden utilizar muchos enfoques biofísicos diferentes, incluidos los sensores de Creoptix. Es relativamente sencillo identificar fragmentos que se enlazan a la mayoría de los sitios de enlace en la mayoría de los destinos. El reto es hacer crecer los fragmentos a compuestos hit más grandes con mayor afinidad antes de comenzar a optimizar las propiedades de los fármacos.

La afinidad de un compuesto (analito, A) que se une a un objetivo (ligand, L) asume un equilibrio simple como:

donde k_d es la disociación o tasa de disociación y k_a la asociación o tasa de conexión y la constante o afinidad de disociación de equilibrio (K_D) es la relación k_d / k_a. En muchos casos, las mejoras en la afinidad se producen cuando las modificaciones en el compuesto dan como resultado una tasa baja más lenta. Se trata de una constante de tasa de primer orden y, por lo tanto, es independiente de la concentración.

Los métodos convencionales de optimización requieren reacciones individuales para sintetizar cada compuesto, seguidas de purificación y constitución del compuesto a una concentración definida antes de medir la afinidad en un ensayo. Vernalis ha sido pionera en un enfoque en el que se criban las mezclas de reacción cruda (CRM), lo que mejora drásticamente la velocidad y el costo de la síntesis para explorar oportunidades de mejorar la afinidad de los compuestos. En el caso de un compuesto hit, se realiza un conjunto de reacciones en paralelo, generalmente en un formato basado en placa, cambiando los sustituyentes incorporados en el compuesto hit. Después de un análisis mínimo, las mezclas de reacción cruda resultantes se evalúan individualmente en busca de cambios en la tasa de disociación para la unión al objetivo; un cambio en la tasa de disociación indica que se ha obtenido un compuesto de mejor afinidad. En la demostración inicial de ese cribado de la tasa de disociación (ORS, Off-Rate Screening)¹ se utilizó la tecnología de Biacore para demostrar mejoras en la eficiencia en términos de materiales, eliminación de desechos asociada y tiempo. Además, se pueden clasificar más compuestos rápidamente en las primeras etapas de un proyecto, cuando la comprensión de las relaciones estructura-actividad (SAR, structure-activity relationships) es potencialmente baja.

La capacidad de detectar de forma fiable cambios en la tasa de disociación es clave para este enfoque. La tecnología patentada de interferometría acoplada en rejilla (GCI) ofrece una sensibilidad superior a las tecnologías tradicionales, como la resonancia de plasmones superficiales (SPR, Surface Plasmon Resonance), lo que permite la determinación fiable de tasas de desviación de hasta 10s^-1. Además, los microfluídicos sin obstrucción de Creoptix WAVE permiten una amplia variedad de disolventes, incluidos acetonitrilo y altas concentraciones de DMSO, lo que aumenta la gama de productos químicos que se pueden utilizar en mezclas de reacción crudas.

En esta nota técnica hemos comparado los resultados de los ORS obtenidos con Creoptix WAVE con los obtenidos previamente por Vernalis con el instrumento Biacore, utilizando retrospectivamente la misma biblioteca de CRM frente a dos objetivos, la Pyruvate deshidrogenasa quinasa 2 (aa16-407), en lo sucesivo denominado PDHK2 y el dominio N-terminal ATPasa de la proteína de choque térmico 90α (aa9–236), en lo sucesivo denominado Hsp90. Vernalis ha identificado previamente una serie de potentes inhibidores para ambos miembros de la familia GHKL de ATPasas.^2,3,4

Materiales y métodos

Cribado de la tasa de disociación de mezclas de reacción cruda (CRM). Ochenta y tres (83) CRM y un compuesto de control purificado fueron cribados para determinar sus desviaciones en el WAVEdelta. Se cargó un WAVEchip PCH-NTA con cloruro de níquel antes de capturar las proteínas diana. Las proteínas HSP90 dobles marcadas con His6 y PDHK2 dobles marcadas con His6 se capturaron a ca. 7000 pg/mm² en los canales 2 y 3 respectivamente. Los canales 1 y 4 estaban cargados de níquel y se utilizaron como canales de referencia. Los CMR se inyectaron a una concentración de aproximadamente 20 μm en HBS-P +1 %DMSO durante 30 s a un caudal constante de 250 μl/min. Se permitió la disociación para 120 s. La determinación de la disociación se realizó mediante el software WAVEcontrol.

Cinética compuesta purificada

Se cargó un WAVEchip PCH-NTA con 0,5 mm de NiCl² antes de la captura de las proteínas. HSP90 y PDHK2 se capturaron en tampón HBS-P a una densidad de ca. 3500 pg/mm2. Se inyectó VER235377 (compuesto purificado) a 30 μl/min en HBS-P + 1 %DMSO a concentraciones crecientes que oscilan entre 27,4 nm y 20 μm (concentraciones de 7, diluciones de 3 veces). Se permitió la inyección para 60 s antes de una fase de disociación de 60 segundos. Todos los análisis de interacción se realizaron a 25 °C y los datos se evaluaron mediante WAVEcontrol. Se utilizó un modelo Langmuir 1:1 para el ajuste de datos y se determinaron los parámetros cinéticos.

Resultados

Vernalis ha sido pionera en el uso del cribado de la tasa de disociación (ORS) para muestrear cinéticamente el hit al espacio químico de plomo.¹ Su experiencia en quimioinformática, síntesis de bibliotecas de compuestos y análisis de resonancia plasmática de superficie (SPR), fue atractiva para este estudio de referencia y permitió el ORS de productos de reacción no purificados (CRM). El cribado CRM identifica rápidamente compuestos de plomo de los fragmentos hits sin purificación de bibliotecas de compuestos ni el uso de estructuras de proteínas. Se realizó un estudio comparativo de ORS utilizando el WAVEdelta (basado en la tecnología GCI) y el Biacore T200 (basado en la tecnología SPR) para comparar y contrastar las dos tecnologías. Específicamente, se midieron compuestos seleccionados en el WAVEdelta y se compararon con una biblioteca CRM probada retrospectivamente (en una Biacore T200) de Vernalis. 

La Figura 1 muestra ejemplos de determinación de la tasa de disociación de CRM seleccionados. En ambos experimentos, los resultados obtenidos de Creoptix WAVEdelta coincidieron con los obtenidos de Biacore T200. Para aquellos compuestos con tasas de disociación superiores a 1s^-1, el WAVEdelta fue capaz de resolver confiablemente esas constantes de disociación muy rápidas (k_off).

Figura 1: Cribado de la tasa de disociación de los CRM seleccionados. Las mediciones se realizaron en un Biacore T200 (panel izquierdo) o en un Creoptix WAVEdelta (panel derecho). Los datos de GCI reproducen los datos de SPR y permiten una determinación de las interacciones de la tasa de disociación más precisa y fiable, más rápido que 1s^-1

Este estudio del cribado de la tasas de disociación condujo a la identificación del mismo hit selectivo de PDHK2 que también se caracterizó como compuesto purificado (VER235377) en el WAVEdelta. Los parámetros cinéticos y la afinidad de unión fueron similares a los obtenidos por el Biacore T200 basado en SPR. La Figura 2 muestra los datos obtenidos por GCI Creoptix WAVEdelta, paneles derechos) y SPR (Biacore T200, paneles izquierdos). Finalmente, identificamos el mismo compuesto hit selectivo de PDHK2 (VER235377).^2,4 Los datos cinéticos obtenidos se muestran en la Tabla 1.

	kon (M-1.s-1)	koff (s-1)	Rmáx (Pg/mm2)	KD (nm)
HSP90 Biacore T200	1,92 x 105	0.130	24.1	679
HSP90 WAVEdelta	1,82 x 105	0.122	25.2	669
PDHK2 Biacore T200	6,10 x 105	0.116	18.3	191
PDHK2 WAVEdelta	3,16 x 105	0.052	14.5	166

Tabla 1: Datos cinéticos del compuesto Tpurificado VER235377 sobre HSP90 y PDHK2

Figura 2: Datos de cinética de unión del compuesto purificado VER235377. Las mediciones se realizaron en un Biacore T200 (panel izquierdo) o en un Creoptix WAVEdelta (panel derecho). Se obtuvieron datos comparables para las proteínas HSP90 y PDHK2

En resumen, con Creoptix WAVE hemos podido:

• Confirmar previamente reportado y medido con un hit Biacore T200 PDHK2 ^2,4
• Confirmar el mismo hit selectivo para PDHK2 VER235377 y caracterizarlo en su forma completamente purificada
• Confirmar la selectividad de VER235377 PDHK2 sobre HSP90
• Mostrar una excelente resolución para compuestos con tasas de disociación muy por encima de 1s^-1, destacando la capacidad de Creoptix WAVE para resolver tasas de disociación rápidas

Conclusión

Creoptix WAVE ofrece datos cinéticos en excelente concordancia con las mediciones de Biacore T200, como lo demuestran los resultados obtenidos para una campaña de compuestos Vernalis medidos retrospectivamente contra Pyruvato deshidrogenasa quinasa 2 (PDHK2) y la proteína de choque térmico 90 (HSP90). Con una alta sensibilidad y capacidad para resolver interacciones extremadamente rápidas, Creoptix WAVE mejora el cribado de compuestos y el análisis cinético de moléculas pequeñas para acelerar el desarrollo de fármacos y reducir significativamente los costes asociados con la purificación de compuestos y objetivos. Por lo tanto, WAVE se encuentra en una posición ideal para cribar bibliotecas de aglutinantes débiles que muestran tasas de disociación muy rápidas, como pequeñas moléculas, fragmentos, péptidos, etc. Combinada con una tecnología microfluídica sin obstrucción que permite el estudio de mezclas de reacción crudas y no purificadas, WAVE está revolucionando y acelerando el proceso de descubrimiento de fármacos.

Conclusiones clave

Capturar la velocidad de la tasa de disociación de compuestos de unión débil en mezclas de reacción crudas con Creoptix WAVEsystem.

• Microfluídicos sin obstrucciones compatibles con mezclas de reacciones crudas: ideales para cribado de la tasas de disociación y diseño de fármacos basados en fragmentos
• Datos comparables con los datos históricos de SPR: La tecnología GCI proporciona datos cinéticos similares a los obtenidos con instrumentos basados en SPR
• Tasas de disociación de buena resolución sobre 1 s^-1: con una transición rápida, WAVEsystem mide las tasas de disociación de hasta 10 s^-1

Ideal para:

• Cribado de la tasa de disociación de mezclas crudas: moléculas, fragmentos y péptidos pequeños
• Progresión rápida del cribado sistemático de candidatos prometedores
• Optimización de candidatos potenciales

Referencias

1. Murray, J.B. y otros. 2014. Cribado de la tasas de disociación (ORS) por resonancia plasmática de superficie. Un método eficaz para muestrear cinéticamente el hit al espacio químico de plomo en productos de reacción no purificados. J. Med. Chem. 57, 2845-1850 doi: /10.1021/jm401848a
2. Brough, P.A. y otros. 2017. Aplicación del cribado de la tasa de disociación en la identificación de nuevos inhibidores panisoformes de la piruvato deshidrogenasa quinasa.J. Med. Chem., 60, 6, 2271–2286. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01478
3. Brough, P. A. y otros. 2009. Combinación de estrategias de identificación de hit: enfoques basados en fragmentos e in sílico para inhibidores de la 2-aminotieno[2,3-d]pirimidina oralmente activos de la chaperona molecular Hsp90. J. Med. Chem. 52, 4794–4809 doi: 10.1021/jm900357y
4. Baker, L. M. y otros. Optimización rápida de fragmentos e hits en compuestos de plomo a partir del cribado de mezclas de reacción crudas. Commun Chem 3, 122 (2020).doi: 10.1038/s42004-020-00367-0

Reconocimientos

Agradecemos a la Dra. Natalia Matassova (Vernalis) por llevar a cabo todos los experimentos y al Prof. Roderick Hubbard por su contribución a esta nota técnica.