Caracterización rápida de la unión a los GPCR no purificados

Resumen

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) son objetivos terapéuticos importantes debido a su función esencial en la regulación de los procesos fisiológicos. Siendo el objetivo de más del 30 % de los medicamentos aprobados, los GPCR tiene fama de ser difíciles de estudiar, ya que su hidrofobicidad los hace extremadamente inestables después de la extracción de la membrana celular.

Con microfluídicos patentados sin obstrucciones, Creoptix WAVE permite a los investigadores investigar los GPCR tanto en solución (solubilizados con detergente o reconstituidos en un entorno lipídico como los nanodiscos) como en membranas, en las que pueden retener su conformación nativa. Utilizando la tecnología patentada de interferometría acoplada a rejilla (GCI, Grating-Coupled Interferometry) patentada para ofrecer una sensibilidad excepcional, Creoptix WAVE puede resolver una amplia gama de afinidades y frecuencias de desconexión para mejorar la comprensión de las interacciones de la proteína G/GPCR.

Caracterizando la cinética de unión y la afinidad de la proteína G, mini-G_o1, a una preparación cruda de receptor de serotonina 5-HT_1B solubilizado n-dodecil β-D-maltosida (DDM) (5-HT_1BR) sin purificar, combinando la inyección de muestra-tampón y un proceso de purificación rápido y “sucio”, mostramos que Creoptix WAVE proporciona información esencial sobre la señalización de GPCR y la farmacología.

Materiales y métodos

Las membranas celulares de insectos de Trichoplusia ni que expresaban el 5-HT_1BR marcado por His, el agonista donitriptan y el mini-G_o1 diseñado fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Chris Tate (Laboratorio de Biología Molecular de MRC - Cambridge, Reino Unido).

Las membranas celulares de ~ 30 ml de cultivo fueron solubilizadas durante 30 min con DDM al 0,5 % y el solubilizado crudo fue recuperado en el sobrenadante después de una centrifugación de 30 min a 20 000 xg. El procedimiento rápido y “sucio” propuesto requiere menos de 1 h y es adecuado para GPCR estables con niveles de expresión de al menos 0,5 mg/l de cultivo celular. Los detalles del proceso de purificación rápido y “sucio” se muestran en la Figura 1.

El 5-HT_1BR marcado con His y solubilizado con DDM se capturó y se acopló con amina en un chip Ni²⁺-NTA (WAVEchip 4PCH-NTA). El mini-G_o1 marcado por His - el control negativo - fue capturado y amino-acoplado en el canal de referencia del WAVEchip. La unión de la proteína G a la GPCR solubilizada se controló mediante el proceso de inyección muestra-tampón (Figura 2), donde el 5-HT_1BR se activa mediante la inyección del agonista donitriptan, antes de la unión del mini-G_o1.

Figura 1: Proceso de purificación de GPCR estándar frente a rápido y “sucio”

Figura 2: Proceso de inyección de tampón de muestra

Resultados

Se registraron curvas dosis-respuesta para 7 concentraciones de mini-G_o1 que oscilaban entre 1 nm y 16,8 μm en el tampón de muestra. El caudal fue de 30 μl/min y las mediciones se realizaron a 10 °C.

La Figura 3 muestra las curvas de unión registradas para la unión mini-G_o1 a 5-HT_1BR solubilizado con DDM y unido mediante donitriptan. Los datos fueron de doble referencia y se ajustaron con un modelo de ligando heterogéneo (que dio cuenta de dos especies de ligando). Los parámetros cinéticos se muestran en la siguiente tabla y los valores de K_D concuerdan con los datos del ensayo de unión de saturación fluorescente (FSBA, fluorescent saturation binding assay) previamente notificados.¹

Figura 3: cinética mini-G_o1

Conclusiones clave

Comprenda la señalización y farmacología de GPCR y acelere el proceso de descubrimiento de fármacos en las primeras fases con Creoptix WAVE:

• Utilice menos material: trabaje con confianza con solubilizados no purificados
• Ahorre tiempo: trabaje con estados de ensayo subóptimos
• Con WAVE diga adiós a procedimientos largos y laboriosos de purificación de receptores: acepte contaminantes y trabaje con muestras crudas sin obstrucciones, microfluídicos robustos

Ideal para:

• Cribado de diferentes proteínas G que se unen al mismo receptor
• Cribado de la unión a la proteína G en diferentes detergentes
• Caracterización del fármaco (agonista inverso, agonista) con la unión a la proteína G como lectura

Referencias

1. Nehmé R, Carpenter B, Singhal A, Strege A, Edwards PC, White CF y otros. (2017) Proteínas mini-G: Nuevas herramientas para estudiar los GPCR en su conformación activa. PLoS 12(4): e0175642.: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0175642