El cribado biofísico de bibliotecas de compuestos para la identificación de ligandos que interactúan con una proteína es eficaz, pero, normalmente, no revela si los ligandos pueden interferir en sus propiedades funcionales ni cómo lo hacen. Para ello se requiere un ensayo bioquímico o funcional. Pero para las proteínas cuya función depende de un cambio conformacional, estos ensayos suelen ser complejos o tienen un rendimiento bajo.
Aquí, hemos explorado un biosensor de generación de segundo armónico (SHG, del inglés Second-Harmonic Generation) de alto rendimiento para detectar fragmentos que inducen cambios conformacionales al unirse a una proteína en tiempo real e identificar regiones dinámicas. Los ensayos de SHG con formato de placa multipocillo se desarrollaron para mutantes de tipo salvaje y seis mutantes de cisteína única manipulados de proteína de unión a la acetilcolina (AChBP), un homólogo de los canales iónicos activados por ligando (LGIC). Se conjugaron con etiquetas activas de segundo armónico mediante el acoplamiento de una amina o maleimida.
El cribado biofísico de bibliotecas de compuestos para la identificación de ligandos que interactúan con una proteína es eficaz, pero, normalmente, no revela si los ligandos pueden interferir en sus propiedades funcionales ni cómo lo hacen. Para ello se requiere un ensayo bioquímico o funcional. Pero para las proteínas cuya función depende de un cambio conformacional, estos ensayos suelen ser complejos o tienen un rendimiento bajo.
Aquí, hemos explorado un biosensor de generación de segundo armónico (SHG, del inglés Second-Harmonic Generation) de alto rendimiento para detectar fragmentos que inducen cambios conformacionales al unirse a una proteína en tiempo real e identificar regiones dinámicas. Los ensayos de SHG con formato de placa multipocillo se desarrollaron para mutantes de tipo salvaje y seis mutantes de cisteína única manipulados de proteína de unión a la acetilcolina (AChBP), un homólogo de los canales iónicos activados por ligando (LGIC). Se conjugaron con etiquetas activas de segundo armónico mediante el acoplamiento de una amina o maleimida.
Para validar el ensayo, se confirmó que los cambios conformacionales inducidos por los agonistas y antagonistas nicotínicos del receptor de la acetilcolina (nAChR) en la AChBP eran cualitativamente diferentes. Posteriormente, se realizó un cribado de una biblioteca de 1056 fragmentos para todas las variantes, y se identificaron con éxito los moduladores conformacionales de AChBP, con tasas de aciertos del 9 al 22 %, dependiendo de la variante de AChBP. Se seleccionó un subconjunto de cuatro aciertos para la validación ortogonal y el análisis estructural. Un ensayo de biosensor basado en interferometría acoplada a la rejilla con resolución temporal confirmó que la interacción era una interacción reversible de un paso 1:1, y proporcionó estimaciones de afinidades y constantes de velocidad de la cinética de interacción (KD = 0,28–63 μm, ka = 0,1–6 μm−1 s−1, kd = 1 s−1). La cristalografía de rayos X de dos de los fragmentos confirmó su unión en un sitio conformacionalmente dinámico antes descrito, que corresponde al sitio regulador de los LGIC.
Estos resultados revelan que SHG tiene la sensibilidad para identificar fragmentos que inducen cambios conformacionales en una proteína. Se caracterizó una selección de aciertos de fragmentos con un perfil de respuesta diferente a los reguladores LGIC conocidos y se confirmó que se unían a regiones dinámicas de la proteína.
