Nesta nota técnica, mostramos como o sistema WAVE pode ser usado para determinar precisamente a cinética no soro. Graças a um design microfluídico sem entupimento, os estudos cinéticos podem ser realizados em condições que imitam o ambiente nativo o mais próximo possível, permitindo a tradução desses resultados para a clínica.
A quantificação sem rótulo das interações moleculares em biofluidos complexos, como o soro, fornece informações valiosas para orientar estudos terapêuticos de anticorpos. No entanto, essas matrizes geralmente colocam os biossensores ópticos sob estresse considerável, pois vários componentes fazem com que os microfluídicos entupam. Isso pode resultar em longos atrasos no programa enquanto a manutenção essencial é realizada.
Empregando microfluídicos descartáveis e inovadores, o WAVE é altamente resistente a entupimentos. Isso possibilita a análise cinética em matrizes fisiologicamente relevantes, proporcionando um insight superior em comparação com as tecnologias tradicionais de Ressonância plasmônica de superfície (SPR).
Medindo a interação entre HER2 e trastuzumabe em matrizes contendo diferentes concentrações de soro, mostramos que o WAVEsystem, com sua tecnologia microfluídica sem entupimento, oferece análise cinética robusta de ligação de anticorpos em biofluidos.
Em um WAVEchip 4PCP, a fusão HER2-FC (Sino Biological, China) foi imobilizada em um canal a 975 pg/mm2 por acoplamento de amina, seguida pela passivação BSA (Roche, Suíça) em todos os canais para atingir 4200 pg/mm2 de proteína total por canal. O tampão de corrida (RB) utilizado para todos os experimentos foi (HBS-EP+ suplementado com 0,5% de BSA). O trastuzumabe (Absolute Antibody, Reino Unido) foi injetado a 150 ul/min por 170 s, seguido de uma etapa de dissociação de 300 s. Para a condição de soro de 0%, o trastuzumabe foi preparado em RB de 100% e diluído a 20 nM (série de diluição de 4 vezes).
Para a condição sérica de 50%, o trastuzumabe foi preparado a partir de 100 nM em soro:RB de 1:1 (v/v). Para a condição sérica de 90%, o trastuzumabe foi preparado a partir de 100 nM em soro:RB de 9:1 (v/v). A regeneração foi realizada a cada vez através da injeção de um pulso de 50 mM de NaOH, 1 M de NaCl. As medições foram ajustadas usando calibração de DMSO, referência dupla e correção de volume em massa durante a avaliação.
| Dados cinéticos | Rmáx (pg/mm2) | kassociado (M-1 s-1) | kdissociado (s-1) | KD (pM) | |
|---|---|---|---|---|---|
| A | 0% de soro | 151,4 | 5,58 x 105 | 3,19 x 10-5 | 57,1 |
| B | 50% de soro | 183,5 | 2,68 x 105 | 9,1 x 10-6 | 34 |
| C | 90% de soro | 100,1 | 2,25 x 105 | 9,49 x 10-6 | 42,1 |
Tabela 1: dados cinéticos para a interação entre HER2 e trastuzumabe em diferentes concentrações séricas.
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Figura 1: sensorgramas da interação entre HER2 e trastuzumabe em diferentes matrizes
