Correlacionando dados de estabilidade térmica da DSC com estabilidade de proteínas para previsão de comportamento de armazenamento de longo prazo em bioterapêutica

Introdução

Durante sua vida útil, a proteína terapêutica será sujeita a uma variedade de condições diferentes em todo processamento e armazenamento. Normalmente, elas envolvem pH baixo, diferentes componentes de tampão e resistências iônicas e flutuações de temperatura durante o armazenamento e transporte. Além disso, a formulação final deverá permanecer estável por vários anos, geralmente à concentrações de proteína muito altas. O fármaco final entregue ao paciente deve reter sua conformação e atividade nativas, com autoassociação e agregação mínimas. Toda ferramenta analítica capaz de selecionar o efeito dessas condições na conformação e autoassociação da proteína auxiliará na seleção de quais candidatos bioterapêuticos serão desenvolvidos mais profundamente e quais serão as condições de processo e formulação utilizadas.

O DSC é comumente utilizado para avaliar a estabilidade térmica e conformacional de uma proteína sob diferentes condições de tampão (1-6). A temperatura de fusão de uma proteína, ou de domínios individuais, pode ser obtida no perfil de DSC (6). Se a reação é reversível, também será possível determinar os parâmetros termodinâmicos do desdobramento. Além do mais, geralmente o desdobramento é acompanhado por uma exotermia correspondente à agregação e precipitação da proteína desdobrada.

A DSC tem sido utilizada para caracterizar o desdobramento induzido termicamente de anticorpos e fragmentos Fc, com as transições dos domínios individuais identificados (6-9). O domínio C_H2 normalmente se desdobra primeiro (7), seguido dos domínios Fab e C_H3.

Vários experimentos controlados (Figura 1) indicam que os domínios C_H2 e C_H3 do fragmento Fc se desdobram a 71,0 ºC e 83,1 ºC, respectivamente, sob condições quase fisiológicas na PBS. A transição térmica do domínio Fab de um anticorpo monoclonal (MAb) normalmente ocorre entre as transições dos domínios C_H2 e C_H3 ou se sobrepões a uma dessas duas transições.

Figura 1: Varreduras de DSC dos fragmentos Fc na PBS.

A SEC ou filtração em gel (GF) é normalmente utilizada como uma análise indicadora de estabilidade que permite a quantificação do monômero e de outras espécies de peso molecular maior geradas por condições às quais a proteína é exposta ou durante o armazenamento.

No trabalho descrito aqui, comparamos a estabilidade de diferentes anticorpos e proteínas conjugadas por Fc armazenadas sob condições variadas a diferentes temperaturas, conforme determinado pela análise SEC-HPLC, com a estabilidade prevista pela DSC no mesmo tampão. Os resultados demonstram que a DSC pode ser utilizada para selecionar condições sob as quais as proteínas se mantêm mais estáveis para armazenamento em longo prazo e também para selecionar as diferentes proteínas relacionadas, como análogos, para sua estabilidade de longo prazo relativa.

Material e métodos

Sample preparation

As amostras foram preparadas em 20 mM de citrato de sódio com 140 mM de NaCl no pH indicado, exceto quando houve indicação contrária. Foram preparados dois conjuntos de amostras idênticas de cada proteína: um para a análise DSC e outro para análise HPLC. Todos os experimentos foram realizados a uma concentração proteica de 0,5 mg/ml.

Temperatura de armazenamento

A temperatura padrão de armazenamento foi de 4 ºC para todas as amostras. No entanto, pode demorar meses ou anos para que se observem alterações na agregação a essa temperatura para a maioria das proteínas utilizadas nesse estudo, refletindo a vida de prateleira de longo prazo desejada para uma proteína terapêutica desejada. Dessa maneira, também foi utilizado 37 ºC como temperatura de armazenamento para concluir esse projeto em um tempo limitado (dois meses).

SEC-HPLC

Foi utilizado para o estudo um sistema SEC-HPLC comercial com detectores de UV on-line, espalhamento de luz e índice de refração (SEC-UV/LS/RI). A coluna SEC Tosoh TSKgel™ G3000SWXL (7,8 × 300 mm) teve uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min, e as amostras foram injetadas nos intervalos indicados. Os cromatogramas de UV foram monitorados a 280 nm.

DSC

Os experimentos de DSC foram realizados utilizando um sistema MicroCal VP-DSC da Malvern. Todas as amostras foram desgaseificadas por cinco minutos antes da análise. A célula de referência foi preenchida com um tampão correspondente ao tampão de amostra. As amostras foram aquecidas de 4 °C a 110 °C a uma taxa de aquecimento de 60 ºC/h. A pré-varredura teve uma duração de 15 minutos, o período de filtragem teve 10 s e o modo/ganho de retorno foi definido como passivo. O ponto intermediário de uma temperatura de transição térmica (Tm ou temperatura de transição térmica) foi obtido por meio da análise dos dados com o software Origin™ 7.

Resultados e discussão

Proteínas conjugadas por Fc

As varreduras DSC de uma proteína X conjugada por Fc em diferentes valores de pH são mostradas na figura 2. Estão inclusas também as temperaturas de transição térmica das varreduras. A um pH 7, há duas transições térmicas a 65,4 ºC e 78,9 ºC, correspondentes ao desdobramento dos domínios CH2 e CH3. A temperatura de transição térmica diminui com um pH menor, e a ordem de estabilidade prevista pela DSC é pH 7 > pH5 > pH 4. A estabilidade real da proteína foi estudada utilizando SEC-HPLC com detectores de UV on-line, espalhamento de luz e índice de refração. A vantagem da utilização de um detector de espalhamento de luz é que o pico do monômero pode ser facilmente confirmado (10). Os cromatogramas SEC de proteínas X conjugadas por Fc armazenadas a 4 ºC, com pH 7 e pH 4, são mostrados nas figuras 3 e 4 respectivamente. A comparação das porcentagens de pico do monômero a intervalos diferentes para amostras de pH 7, pH 5 e pH4 armazenadas a 4 ºC é mostrada na figura 5. Todos os valores de porcentagem dos dados do monômero SEC nesta nota da aplicação são normalizados em relação ao valor T = 0.

Figura 2: Varreduras DSC de proteína X conjugada por Fc a um pH 7, pH 5 e pH 4.

Figura 3: Cromatogramas SEC (absorção a 280 nm) de proteína X conjugada por Fc a um pH 7, temperatura de armazenamento 4° C. Os intervalos de injeção são T000 = 0 h, TM30 = 30 min, T001 = 1 h e T150 = 150 h.

Figura 4: Cromatogramas SEC (absorção a 280 nm) de proteína X conjugada por Fc a um pH 4, temperatura de armazenamento 4° C. Os intervalos de injeção são T000 = 0 h, TM30 = 30 min, T001 = 1 h e T150 = 150 h.

Figura 5: Estabilidade de anticorpos a 4°C. Comparação de porcentagem do pico do monômero a diferentes intervalos para pH 7, pH 5 e pH 4. Todos os valores de porcentagem dos dados do monômero SEC nesta nota da aplicação são normalizados em relação ao valor T = 0.

Como é muito difícil diferenciar a estabilidade de amostras de pH7 e pH5 em algumas semanas a 4 ºC, os estudos acelerados foram realizados a 37 ºC. A comparação da porcentagem do pico do monômero de SEC obtida em diferentes intervalos para amostras de pH 7 e pH5 é mostrada na figura 6. Com armazenamento a 37 ºC, a estabilidade de proteínas X conjugadas por Fc a um pH7 e pH5 é diferenciada claramente. O aumento da porcentagem do pico do monômero para mais de 100% para as amostras armazenadas a 37 ºC deve-se a evaporação, observada para todas as amostras obtidas a 37 ºC, e resultou em um aumento da concentração proteica em todas as amostras.

Figura 6: Estabilidade de anticorpos a 37°C. Comparação de porcentagem do pico do monômero a diferentes intervalos obtidos de SEC para pH 7 e pH 5.

Os resultados de SEC dos dois conjuntos de experimentos acima (4 ºC e 37 ºC) sugerem claramente que a estabilidade real da proteína X conjugada por Fc é pH 7 > pH 5 > pH 4, confirmando a previsão da DSC.

As varreduras de DSC de proteína X conjugada por Fc a um pH 6 e pH 5 são mostradas na figura 7. A comparação da porcentagem do pico do monômero em diferentes intervalos após o armazenamento a 37 ºC, obtida de SEC para pH 6 e pH 5, é mostrada na figura 8. Novamente, os resultados sugerem que a ordem de estabilidade prevista pela DSC, pH6 >pH 5, pode ser muito bem correlacionada aos dados de estabilidade real obtidos de SEC.

Figura 7: Varreduras DSC de proteína X conjugada por Fc a um pH 6 e pH 5.

Outro fator que contribui para a aparente estabilidade térmica é a solubilidade da proteína desdobrada. Por meio da utilização do MicroCal VP-DSC da Malvern, a exotermia final (curva acentuada para baixo na direção negativa) após a transição reflete a solubilidade da proteína desdobrada. Esse é outro fator, além da temperatura de transição, que pode impactar a estabilidade da proteína significativamente.

A agregação/precipitação é uma reação irreversível. À medida que ocorre, o equilíbrio reversível da reação de desdobramento é modificado em favor da forma desdobrada da proteína. Assim, quanto menos solúvel o intermediário desdobrado, maior será a ocorrência de desdobramento e agregação ao longo do tempo. Se a agregação for simultânea à primeira transição térmica, ele ocorrerá antes da reação completa. Isso complicará a análise.

Anticorpos

Após o estudo da proteína X conjugada por Fc, o mesmo método e procedimento foram utilizados para um MAb. As varreduras DSC de um MAb em diferentes valores de pH são mostradas na figura 9. As temperaturas térmicas são identificadas na figura. A um pH 7, ocorre somente uma transição térmica, a 73,2 ºC, seguida quase imediatamente de uma exotermia de agregação. Quando o pH diminui, a estabilidade térmica do domínio C_H2 também diminui, e os valores de Tm são 66,1 °C e 47,9 °C para as amostras de pH 5 e pH 4 respectivamente. A ordem de estabilidade prevista pela DSC é pH 7 > pH 5 > pH 4.

Figura 8: Comparação da estabilidade a 37 ºC, porcentagem do pico do monômero a diferentes intervalos obtidos de SEC para pH 6 e pH 5.

Figura 9: Varreduras DSC de MAb Y a um pH 7, pH 5 e pH 4.

A estabilidade proteica real foi novamente estudada utilizando SEC-HPLC. O pico do monômero foi confirmado pelo método de detecção de espalhamento de luz (10). Foram comparadas as porcentagens do pico do monômero em diferentes intervalos para as amostras pH7 e pH 4 armazenadas a 4 ºC (resultados não mostrados). Como não foi viável conduzir experimentos prolongados para diferenciar a estabilidade de MAb Y a um pH 7 em comparação a pH 4 com armazenamento a 4 ºC durante vários meses, os estudos de degradação acelerada foram realizados a 37 ºC.

A comparação da porcentagem do pico do monômero obtida de SEC para as amostras de pH 7, pH 5 e pH4 armazenadas a 37 ºC é mostrada na figura 10. Os resultados confirmam a ordem de estabilidade pela DSC: pH 7 (levemente) > pH 5 (significativamente) > pH 4.

Figura 10: Comparação da estabilidade a 37 °C, porcentagem do pico do monômero de MAb Y a intervalos diferentes obtida de SEC para amostras de pH 7, pH 5 e pH 4.

Diferentes proteínas no mesmo tampão

Conforme descrito anteriormente, estudamos a correlação entre a estabilidade térmica e a estabilidade proteica a diferentes valores de pH para a mesma proteína. Também foi nossa intenção investigar se poderíamos utilizar a mesma abordagem para comparar a estabilidade de diferentes proteínas sob as mesmas condições de tampão. Em geral, quando comparamos as diferentes proteínas, a correlação entre estabilidade térmica e
estabilidade relativa em longo prazo diminui conforme diminui também a semelhança estrutural das proteínas. A DSC foi utilizada com sucesso para avaliar a estabilidade de proteínas relacionadas, inclusive selecionando análogos da mesma proteína.

As comparações das temperaturas de transição térmica das varreduras de DSC de MAb Y e a proteína X conjugada por Fc a um pH 4, pH 5 e pH 7 são mostradas na figura 11. As comparações das porcentagens do pico do monômero de MAb Y e proteína X conjugada por Fc a um pH 4, pH 5 e pH 7 são mostradas nas figuras 12 a 14. A um pH 4 e pH 5, a previsão da DSC da ordem de estabilidade (MAb Y > proteína X conjugada por Fc) é claramente confirmada pelos dados de estabilidade de SEC. Os dados de pH 7 são mais complicados. Os dados de estabilidade da DSC mostram que MAb Y é mais estável do que a proteína X conjugada por Fc, mas a diferença dos dados SEC não é óbvia.

Há vários fatores possíveis que podem contribuir para isso. Um consiste em que ambas as proteínas são muito estáveis a um pH 7 e é necessário um tempo de armazenamento muito maior para que se percebam as diferenças na quantidade de monômeros utilizando SEC. Outra razão possível é que a proteína X conjugada por Fc desdobrada é mais solúvel do que MAb Y (figura 2 e 9) e isso compensa parcialmente a diferença das temperaturas de transição térmica e torna a estabilidade real de ambas as proteínas mais similares do que poderia ser previsto com base somente na temperatura de transição térmica. Isso sugere que a exotermia de agregação também é um fator importante a ser considerado.

A abordagem descrita neste artigo também foi utilizada para estudar várias proteínas diferentes, tanto anticorpos como conjugados Fc. A ordem relativa da estabilidade térmica obtida dos dados da DSC refletiu, na verdade, não somente a estabilidade de armazenamento e agregação reais da mesma proteína em diferentes tampões observadas na análise SEC-HPLC, mas também a estabilidade de armazenamento e agregação reais de diferentes proteínas relacionadas em geral.

Após o estabelecimento da correlação entre a estabilidade térmica e a estabilidade de armazenamento de uma proteína em particular, a DSC pode ser utilizada para avaliar rapidamente diferentes mutantes, diferentes padrões, proteínas relacionadas à Fc e MAbs. Conforme mostrado acima, outros fatores, como a solubilidade dos intermediários de proteína desdobrada e semelhanças e diferenças na estrutura da proteína, devem ser considerados juntamente com a temperatura de transição térmica.

Figura 11: Comparação das temperaturas de transição térmica das varreduras de DSC de MAb Y e a proteína X conjugada por Fc a um pH 7, pH 5 e pH 4.

Figura 12: Comparação da porcentagem do pico do monômero de MAb Y e da proteína X conjugada por Y a um pH 4. Temperatura de armazenamento 4°C.

Figura 13: Comparação da porcentagem do pico do monômero de MAb Y e da proteína X conjugada por Y a um pH 5. Temperatura de armazenamento 37°C.

Figura 14: Comparação da porcentagem do pico do monômero de MAb Y e da proteína X conjugada por Y a um pH 7. Temperatura de armazenamento 37°C.

Conclusões

A DSC foi utilizada para estudar a estabilidade térmica de anticorpos monoclonais e proteínas conjugadas por Fc a diferentes valores de pH. A SEC-HPLC foi utilizada para estudar a estabilidade de armazenamento do mesmo conjunto de proteínas a valores de pH correspondentes. Os dados de estabilidade de SEC-HPLC apresentam boa correspondência com a estabilidade prevista pela DSC, sugerindo que os dados de estabilidade térmica obtidos da DSC se correlacionam à estabilidade da proteína a temperaturas mais baixas. Além disso, a estabilidade térmica relativa das proteínas relacionadas também reflete as diferenças em sua estabilidade de longo prazo real. Assim, a DSC é uma ferramenta útil para prever a estabilidade da proteína a temperaturas mais baixas, selecionar tampões e excipientes, selecionar candidatos terapêuticos e prever agregação de proteínas.

Agradecimento

Esta nota de aplicação foi gentilmente cedida por Jie Wen, Yijia Jiang, Kathryn Hymes*, Ke Gong* e Linda Narhi, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA.
*estagiários de verão

Referências

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