원액 반응 혼합물의 선별

서론

단편 선별은 약물 발견 프로세스에서 초기 유효물질을 식별하기 위한 강력한 접근법으로 부상하고 있습니다. 주요 특징은 적은 수(1000s)의 저분자량(일반적으로 <250 Da) 화합물의 표적 결합이 선별된다는 것입니다. 화합물의 크기가 작다는 것은 화합물이 결합될 가능성이 높지만 친화도가 약하다는 것을 의미하며, Creoptix 센서를 비롯한 다양한 생물물리학적 접근법을 사용할 수 있습니다. 대부분의 표적에서 대부분의 결합 부위에 결합되는 단편을 식별하는 것은 비교적 간단합니다. 문제는 약물 특성에 대한 최적화를 시작하기 전에 단편을 더 높은 친화도를 가진 더 큰 유효물질로 증식하는 것입니다.

표적(리간드, L)에 대한 화합물(분석물, A) 결합의 친화도는 다음과 같이 단순 평형 상태를 가정합니다.

여기서 k_d는 해리 속도, k_a는 결합 속도이고, 평형 해리 상수 또는 친화도(K_D)는 비율 k_d/k_a입니다. 많은 경우, 화합물에 대한 수정으로 인해 해리 속도가 느려질 때 친화도가 향상됩니다. 이는 1차 속도 상수이므로 농도와 무관합니다.

기존의 최적화 접근법은 개별 반응으로 각 화합물을 합성하고 정제한 후 분석법에서 친화도를 측정하기 전에 정의된 농도에서 화합물을 구성하는 과정을 수행해야 합니다. Vernalis는 합성의 속도 및 비용을 크게 개선하여 화합물 친화도를 개선할 기회를 모색하는 원액 반응 혼합물(CRM)을 선별하는 방식을 개척했습니다. 유효물질의 경우 일련의 반응은 일반적으로 판 기반 형식으로 병렬 수행되어 유효물질에 통합된 치환기를 변경합니다. 최소 작업 후 결과 원액 반응 혼합물이 표적에 결합하기 위한 해리 속도 변화를 개별적으로 평가합니다. 해리 속도의 변화는 향상된 친화도의 화합물을 얻었음을 나타냅니다. 이러한 해리 속도 선별(ORS)¹의 초기 시연에서는 Biacore 기술을 사용하여 물질, 관련 폐기물 처리 및 시간 측면에서 효율성이 향상되었음을 입증했습니다. 또한 구조-활성 관계(SAR)에 대한 이해가 낮은 경우 프로젝트 초기 단계에서 더 많은 화합물의 순위를 빠르게 지정할 수 있습니다.

이 접근법의 핵심은 해리 속도의 변화를 안정적으로 감지하는 능력입니다. 독점 도파관 간섭법(GCI) 기술은 표면 플라즈마 공명(SPR)과 같은 종래 기술에 비해 뛰어난 감도를 제공하여 최대 10s^-1의 해리 속도를 안정적으로 측정할 수 있습니다. 또한 Creoptix WAVE의 막힘 없는 미세유체는 아세토니트릴 및 고농도 DMSO를 포함한 다양한 용제를 허용하여 원액 반응 혼합물에 사용할 수 있는 화학 물질의 범위를 확대합니다.

이 기술노트에서는 Creoptix WAVE로 얻은 ORS 결과를 이전에 Vernalis가 Biacore 기기에서 두 개의 표적인 피루베이트 디히드로게나제 키나아제 2(aa16-407)(이하 PDHK2로 지칭) 및 PDHK2 및 열충격 단백질 90α(a9–236)의 N-말단 ATPase 도메인(이하 Hsp90으로 지칭)에 대해 동일한 CRM 라이브러리를 사용하여 후향적으로 얻은 결과와 비교했습니다. Vernalis는 GHKL ATPase 계열의 멤버 모두에 대한 일련의 강력한 억제제를 식별했습니다.^2,3,4

실험방법

원액 반응 혼합물(CRM)에 대한 해리 속도 선별. WAVEdelta에서 CRM 83개 및 정제된 대조 화합물 1개에 대해 해리 속도를 선별했습니다. 표적 단백질을 포획하기 전에 PCH-NTA WAVEchip에 니켈 클로라이드를 로딩했습니다. 두 개의 His6 표지 HSP90과 두 개의 His6 표지 PDHK2 단백질을 각각 채널 2 및 3에서 약 7000pg/mm²로 포획했습니다. 채널 1 및 4는 니켈이 로딩되었으며 참조 채널로 사용되었습니다. CRM을 HBS-P + 1% DMSO에서 약 20μm 농도로 30초간 약 250μl/min의 일정한 유량으로 주입했습니다. 120초간 해리가 허용되었습니다. 오프셋 측정은 WAVEcontrol 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다.

정제 화합물 동역학

단백질을 포획하기 전에 PCH-NTA WAVEchip에 0.5mM NiCl²을 로딩했습니다. HSP90 및 PDHK2를 HBS-P 완충액에서 약 3,500pg/mm2 밀도로 포획했습니다. VER235377(정제 화합물)을 27.4nM ~ 20μm 범위의 농도(7개 농도, 3배 희석)로 HBS-P + 1% DMSO에서 30μl/min으로 주입했습니다. 60초간 주입 후 60초간 해리 단계가 허용되었습니다. 모든 상호작용 분석은 25°C에서 수행했으며 데이터 평가에는 WAVEcontrol을 사용했습니다. Langmuir 1:1 모델을 데이터 피팅에 사용했으며 동역학 매개 변수를 결정했습니다.

결과

Vernalis는 유효물질 대 선도물질 화학 공간에서 동역학적으로 샘플을 채취하는 데 해리 속도 선별(ORS) 사용을 개척해 왔습니다.¹ 화학정보학, 화합물 라이브러리 합성 및 표면 플라즈마 공명(SPR) 분석 분야의 전문성은 이 벤치마크 연구에서 매력적인 것으로 확인되었으며 미정제 반응물(CRM)의 ORS를 가능하게 했습니다. CRM 선별은 화합물 라이브러리의 정제 또는 단백질 구조의 사용 없이 절편 유효물질에서 선도물질을 신속하게 식별합니다. 한 비교 ORS 연구에서 WAVEdelta(GCI 기술 기반)와 Biacore T200(SPR 기술 기반)을 사용하여 두 기술을 대조했습니다. 특히 선택된 화합물은 WAVEdelta에서 측정되고 Vernalis의 Biacore T200에서 후향적으로 테스트된 CRM 라이브러리와 비교되었습니다. 

그림 1은 선택된 CRM의 해리 속도 측정 예를 보여줍니다. 두 실험 모두에서 Creoptix WAVEdelta에서 얻은 결과가 Biacore T200에서 얻은 결과와 일치했습니다. 해리 속도가 1s^-1을 넘는 화합물에 대해 WAVEdelta는 매우 빠른 해리 상수(k_off)를 신뢰성 있게 측정할 수 있었습니다.

그림 1: 선택된 CRM의 해리 속도 선별 측정은 Biacore T200(왼쪽 패널) 또는 Creoptix WAVEdelta(오른쪽 패널)에서 수행되었습니다. GCI 데이터는 SPR 데이터를 재현하며 1s^-1보다 빠른 상호작용의 해리 속도를 정확하고 보다 신뢰성 있게 측정할 수 있습니다.

이 해리 속도 선별 연구는 WAVEdelta에서도 정제 화합물(VER235377)로 특성 분석된 동일한 PDHK2 선택적 유효물질을 식별했습니다. 동역학 매개 변수 및 결합 친화도는 SPR 기반 Biacore T200에서 얻은 매개 변수와 유사했습니다. 그림 2는 GCI Creoptix WAVEdelta(오른쪽 패널) 및 SPR(Biacore T200, 왼쪽 패널)에서 얻은 데이터를 보여줍니다. 마지막으로 동일한 PDHK2 선택적 유효물질(VER235377)을 식별했습니다.^2,4 획득된 동역학 데이터는 표 1에 나와 있습니다.

	kon(M-1.s-1)	koff(s-1)	Rmax(pg/mm2)	KD(nM)
HSP90 Biacore T200	1.92x105	0.130	24.1	679
HSP90 WAVEdelta	1.82x105	0.122	25.2	669
PDHK2 Biacore T200	6.10x105	0.116	18.3	191
PDHK2 WAVEdelta	3.16x105	0.052	14.5	166

표 1: HSP90 및 PDHK2를 통한 정제 화합물 VER235377의 동역학 데이터

그림 2: 정제 화합물 VER235377의 결합 동역학 데이터 측정은 Biacore T200(왼쪽 패널) 또는 Creoptix WAVEdelta(오른쪽 패널)에서 수행되었습니다. 단백질 HSP90 및 PDHK2에 대해 비교 가능한 데이터가 얻어졌습니다.

요약하면 Creoptix WAVE에서 다음이 가능했습니다.

• 이전에 Biacore T200 PDHK2를 사용하여 보고 및 측정된 유효물질을 확인^2,4
• 동일한 PDHK2 선택적 유효물질 VER235377을 확인하고 완전히 정제된 형태로 특성 분석
• HSP90에 대한 VER235377 PDHK2 선택성을 확인
• 1s^-1보다 훨씬 큰 해리 속도를 가진 화합물에 대해 우수한 분해능을 보여 빠른 해리 속도를 판별하는 Creoptix WAVE의 능력을 입증

결론

Creoptix WAVE 는 피루베이트 디히드로게나제 키나아제 2(PDHK2) 및 열충격 단백질 90(HSP90)에 대해 후향적으로 측정된 Vernalis 화합물 캠페인을 통해 얻은 결과에서 보듯이 Biacore T200 측정치와 매우 일치하는 동역학 데이터를 제공합니다. 매우 빠른 상호작용을 판별할 수 있는 고감도 기능을 갖춘 Creoptix WAVE는 화합물 선별 및 소분자의 동역학 분석을 개선하여 약물 개발을 가속화하고 표적 및 화합물 정제와 관련된 비용을 크게 절감합니다. 따라서 WAVE는 소분자, 단편, 펩타이드 등과 같이 매우 빠른 해리 속도를 보이는 약한 결합체 라이브러리를 선별하는 데 이상적입니다. WAVE는 미정제 원액 반응 혼합물을 연구할 수 있는 막힘 없는 미세유체 기술과 결합되어 약물 발견 프로세스를 혁신하고 가속화합니다.

핵심 내용

Creoptix WAVEsystem을 사용하여 원액 반응 혼합물에서 약하게 결합되는 화합물의 빠른 해리 속도를 포착합니다.

• 원액 반응 혼합물과 호환되는 막힘 없는 미세유체: 해리 속도 선별 및 단편 기반 약물 설계에 이상적입니다.
• SPR 기록 데이터와 비교할 수 있는 데이터: GCI 기술은 SPR 기반 기기를 통해 얻은 것과 유사한 동역학 데이터를 제공합니다.
• 1s^-1보다 훨씬 높은 해리 속도 측정: WAVEsystem은 빠른 전환을 통해 최대 10s^-1의 해리 속도까지 측정합니다.

적합한 용도:

• 원액 혼합물의 해리 속도 선별: 소분자, 단편 및 펩타이드
• 빠른 선도물질 진행 과정
• 선도 물질 최적화

참고 문헌

1. Murray, J.B. et al. 2014. Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance. An efficient method to kinetically sample hit to lead chemical space in unpurified reaction products. J. Med. Chem. 57, 2845-1850 doi: /10.1021/jm401848a
2. Brough, P.A. et al. 2017. Application of Off-Rate Screening in the Identification of Novel Pan-Isoform Inhibitors of Pyruvate Dehydrogenase Kinase.J. Med. Chem., 60, 6, 2271–2286. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01478
3. Brough, P. A. et al. 2009. Combining hit identification strategies: fragment-based and in silico approaches to orally active 2-aminothieno[2,3-d]pyrimidine inhibitors of the Hsp90 molecular chaperone. J. Med. Chem. 52, 4794–4809 doi: 10.1021/jm900357y
4. Baker, L .M. et al. Rapid optimization of fragments and hits to lead compounds from screening of crude reaction mixtures. Commun Chem 3, 122 (2020).doi: 10.1038/s42004-020-00367-0

공지 사항

모든 실험을 수행해주신 Natalia Matassova 박사(Vernalis)와 이 기술노트에 기여한 Roderick Hubbard 교수에게 감사드립니다.