분절 기반 약물 발견 캠페인에서 Malvern MicroCal Auto-iTC200을 적용할 수 있는 여러 응용 분야

서론

이 작업에서는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(Vps34)의 활성을 억제하는 선도 물질 화합물을 식별하고 최적화하는 분절 기반 약물 발견(FBDD) 접근법을 개략적으로 설명합니다. 이 키나아제는 암 치료제에 대한 저항성 측면에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다(1, 2). Vps34는 자식 작용 활성화에 중요하고 치료적 개입 대상으로 확인되었습니다. 자식 작용, 또는 자율 흡수 작용은 리소좀 기계류를 통한 셀 구성 요소의 분해와 관련된 이화 작용 프로세스로, 발암에 중요한 메커니즘으로 확인되고 있습니다.

MicroCal Auto-iTC200은 대상 단백질 전처리에 필요한 최소한의 단계와 분석 설계의 단순성으로 인해 이 캠페인에서 중요한 역할을 했습니다. MicroCal Auto-iTC200 데이터를 사용하여, 가장 강력한 결합재만 공결정화를 시도하고 구조 기반 약물 발견 프로그램을 진행하도록 열 이동 기반 1차 검사에서 유효 물질을 검증하고 분절의 친화도 순위를 정확하게 매겼습니다. 이 접근법은 등온 적정 열량측정법(ITC) 검증에서 선택한 단백질 복합체 14개 중 12개가 성공적으로 결정화됨에 따라 대상과 함께 공결정 복합체를 형성하는 유효 물질을 성공적으로 예측할 수 있음이 입증되었습니다. 이 장비를 사용하여 구조 기반 의료 화학 프로그램에서 후속 최적화 반복 작업의 성공 여부를 평가했습니다.

그림 1. FBDD 캠페인 작업 흐름의 개요. 분절 라이브러리는 열 이동 분석을 사용하여 검사했습니다. 그 결과로 도출된 분절 유효 물질은 MicroCal Auto-iTC200을 사용하여 검증했습니다. 대상 단백질의 열 안정성과 유효 물질의 안정화 효과는 MicroCal VP-Capillary DSC를 사용하여 분석하고 검증했습니다. ITC로 확인한 유효 물질은 공결정화되었습니다. 의료 화학, MicroCal Auto-iTC200을 사용한 유효 물질 특성 분석 및 공결정화로 이루어진 최적화 과정으로 인해 일련의 화학 물질이 유발되었습니다. DSC를 사용하여 대상 단백질의 안정성을 분석하고 열 이동 데이터의 일부를 검증했습니다.

재료 및 방법

단백질 및 분절은 Sprint Bioscience(스웨덴 스톡홀름)에서 제공했습니다. MicroCal Auto-iTC200과 MicroCal VP-Capillary DSC는 Malvern Instruments에서 사용할 수 있습니다. 모든 실험은 25°C에서 실시했습니다.

MicroCal Auto-iTC200 시료 셀은 20mM 트리스 pH 7.5, 300mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5mM TCEP 및 2% 또는 5% DMSO로 채웠습니다. 약한 결합재(K_D > 10µM)라고 생각되는 분절은 50µM 단백질 농도에 대해 4mM의 농도로 주입했습니다. 더 강력한 결합재는 20µM 단백질 농도에 대해 200µM의 농도로 주입했습니다. 주입 용량은 12회 주입에 대해 각각 3 µl였고 주입 시간은 6초이고 각 주입 사이의 지연 시간은 150초였습니다. 각 실험은 총 20분이 소요되었습니다. 이 분절의 분자량 범위는 149 ~ 333Da였습니다. MicroCal VP-Capillary DSC를 사용하여 분절에 대한 선택 물질이 존재하거나 존재하지 않는 경우 분석 완충액에서 대상 단백질의 열 안정성을 평가했습니다. DSC 스캔에서 단백질 농도는 0.2mg/ml이고 분절 농도는 1mM였습니다. 주사 속도는 60°C/h였습니다.

1차 검사

1mM의 농도에서 각 분절이 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 단백질이 가열된 경우 약 500 분절에 대한 라이브러리는 열 이동 접근법을 사용하여 Vps34에 대해 검사했습니다. 단백질 변성 공정은 시차 주사 형광측정법(DSF)을 사용하여 모니터했습니다. 이 측정법의 목적은 선도 물질 생성과 최적화 공정에 대한 구조 정보를 수집하기 위해 성공적으로 공결정화될 수 있는 결합재를 발견하는 것입니다.

단백질 고정화에 필요한 결합 분석을 개발하려고 시도하는 동안 나타난 단백질 불안정성 문제와 관련하여 MicroCal Auto-iTC200은 특히 이 프로젝트에 적합했습니다. 최소한의 전처리 단계가 필요하고 이로 인해 단백질 변성의 위험이 줄어들므로 ITC를 유효 물질 검증 방법으로 선택했습니다. MicroCal AutoiTC200을 사용하면 글리세롤이 포함된 점성이 있는 완충액에서 분석을 쉽고 간편하게 수행할 수 있습니다. MicroCal VP-Capillary DSC를 사용한 단백질 안정성에 대한 기본 특성 분석의 경우, 경미한 열 안정성 문제는 다루지 않았습니다(4% DMSO가 포함된 분석 완충액의 Tm=50°C). DSC는 열 이동 분석에서 얻은 두 유효 물질의 안정화 효과를 확인했습니다. 이 작업 과정 동안 식별된 분절 중의 하나는 ITC에 의해 결합재로 확인되었고 공결정 구조를 생성했지만 DSF 실험에서 음성 변이를 제공하는 것으로 판명되었습니다. 특성 분석 중 이 분절은 DSC에서 시험할 때 대상 단백질을 안정화하는 것으로 나타났습니다. 이를 통해 열 안정성 분석에서 직교 방법을 사용하는 것과 DSF 1차 검사에서 음성 변이를 제공하는 분절 중에서 결합재를 식별하는 것이 중요함을 알 수 있습니다.

용량 반응 열 이동 연구에서 1차 검사에서 얻은 유효 물질에 대한 후속 조치를 실시했습니다(그림 2). 성공적인 열 이동과 ITC 분석에 필요한 것은 분절에 대한 높은 용해도입니다. 유효 물질과 해당 분절의 제한된 용해도를 반영하는 용량 반응 곡선의 강하는 향후 연구에서 배제될 수 있습니다. 용량 반응 곡선이 생성될 수 있는 분절은 MicroCal Auto-iTC200을 사용하여 이차 분석에서 검증했습니다.

그림 2. 두 가지 열 이동 실험에 대한 용량 반응 플롯의 예 Tm 변이는 분절 농도에 대해 플롯됩니다. 분절 SB002-41은 제한된 용해도로 인해 곡선은 하강을 나타냈고 향후 연구에서 배제되었습니다.

MicroCal Auto-iTC200에 의한 유효 물질 검증

단백질에는 불안정화 위험을 줄이는 극소수의 전처리 단계가 필요하므로 MicroCal Auto-iTC200을 유효 물질을 검증하기 위한 방법으로 선택했습니다.

등온 적정 열량측정계는 분자가 자유상태에서 결합상태로 이동하면서 상호작용하는 경우에 발생하는 열 변화를 측정합니다. 측정 작업에서 얻은 등온선은 친화도(K_D), 화학량(N) 및 상호 작용에 대한 엔탈피(ΔH)를 생성하는 결합 모델에 적합합니다. 이 연구에서는 결정화에 대한 더 강력한 결합재를 선택하기 위해 친화도를 사용하여 분절의 순위를 매겼습니다.

열 이동 검사에서 선택한 47개 분절 중에서 33개는 친화도를 정량화하는데 사용할 수 있는 양호한 결합 데이터를 제공했습니다. 14개는 결합으로 인한 열이 발생하지 않았거나 비정상적인 등온선을 보였습니다(그림 3). MicroCal Auto-iTC200의 원시 데이터 검사를 통해 열 이동 분석에서 생성된 유효 물질 중에서 위양성 물질을 조기에 식별하고 제거했습니다. 친화도를 위해 33개 유망한 분절의 순위를 매겼고 20개의 가장 강력한 결합재를 재검사하여 친화도 측정 결과가 정확한지를 평가했습니다. 일차 및 이차 검사에서 얻은 데이터는 결합재의 약점에도 불구하고 동의하기에 합당한 결과를 보여주었습니다(그림 4).

그림 3. MicroCal Auto-iTC200으로 분석한 분절의 예 왼쪽 및 중앙의 그래프는 친화도가 (A) 0.9mM 및 (B) 4µM인 분절의 원시 데이터(상단 패널)와 결합 등온선(하단 패널)을 나타냅니다. 이 화합물에서 향후 연구를 위해 더 강력한 결합재를 선택했습니다. K_D 농도의 단백질이 과다한 양의 화합물 (3)으로 적정되는 경우 낮은 친화도 분절 (A)의 데이터는 낮은 C 적정 설정의 예를 나타냅니다. (C)는 비정상적인 등온선으로 인해 거부된 분절의 원시 데이터를 보여 줍니다. 이 피크는 광범위하고 다음 주입 전 기준선으로 복귀하지 않습니다. 이는 느린 (리간드 유도) 응집 공정 또는 리간드의 느린 해리와 같은 느린 작용을 나타냅니다. 후자 거동은 시린지에서 높은 농도의 저분자가 응집하고 희석 시 해리되는 경우 유발될 수 있습니다. 결합에 대한 분명한 조짐과 비정상적인 거동에 대한 증거가 없으므로 이 재료는 1차 검사에서 위양성 물질로 밝혀질 수 있습니다. (D)는 일차 2회 주입에서 발열 거동을, 후속 주입에서 흡열 거동을 나타낸 분절의 원시 데이터를 보여 줍니다. 이 복잡한 거동은 위양성 물질에 의해 유발될 수 있고 이 화합물은 향후 연구에서 배제되었습니다.

그림 4. 측정된 분절 친화도의 정확성 친화도 측정의 재현성을 평가하기 위해 동일한 단백질에 대한 두 가지 측정을 서로에 대해 플롯합니다.

이 데이터에 따라 공결정 구조 측정을 위해 14개 분절을 선택했습니다. 이 중에서 12개는 성공적이었는데(그림 5), 단백질 분절 공결정 구조를 성공적으로 측정하고 향후 화학 물질 개발에 분절을 도입하기 위한 우수한 예측 도구로서 MicroCal Auto-iTC200의 유용성을 보여 주었습니다.

그림 5. Vps34에 대한 분절 결합의 결정 구조

선도 물질 생성

이차 검사를 실시한 47개 유효 물질은 5개의 다양한 화학 물질을 보여 주었습니다. 이차 검사에서 식별된 가장 단단한 결합재는 이러한 2개의 화학 물질에서 생성되었고 의료 화학 프로그램에서 최적화되었습니다. 화합물의 다음 반복 작업에는 두 화학 물질의 구조 요소가 포함되었고 MicroCal Auto-iTC200을 사용하여 대상 단백질의 결합을 검증했습니다(그림 6). 분절의 이차 생성의 경우 대상 단백질의 결합 친화도가 현저하게 개선되었고 구조 활성 관계(SAR) 기반 분석으로서 ITC의 적용성을 보여 줍니다.

그림 6. 두 화학 물질과 더 단단한 결합재의 재결합 예 ITC 측정은 다음 반복 작업에 대해 향상된 친화도를 나타냈습니다.

결론

MicroCal Auto-iTC200은 여기에 기록된 분절 기반 캠페인에 대한 약물 발견 작업 흐름에 성공적으로 통합되었습니다. 이 장비는 시료 전처리가 거의 필요 없고 최소한의 분석 개발을 간편하게 수행하며, 일관적이고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다. 다른 직교 분석에서 제한된 안정성을 나타낸 단백질에 대한 유효 물질 검증에서 이 장비는 이차 검사 도구로 성공적으로 사용되었습니다. 시스템 데이터를 사용하면 1차 검사로 생성된 위양성 물질의 초기 식별과 제거가 가능하므로 이 기법은 단백질 분절 공결정 구조의 성공적인 측정을 위한 우수한 예측 도구로 판명되었습니다.

요약하면, ITC는 SAR(구조 활성 관계) 분석법으로, 일련의 분절의 우선 순위를 매기고 약물 발견 공정의 일부인 분절에 대한 다음 반복 작업과 관련된 화학 물질 개발을 안내하는 데 사용할 수 있는 K_D 값을 제공합니다. 간편한 사용과 뛰어난 감도를 제공하도록 설계된 전자동 MicroCal Auto-iTC200은 프로젝트 수행을 위한 유용한 도구입니다.

감사의 글

열 이동 분석과 X선 연구에서 얻은 데이터와 함께 단백질 물질과 분절은 Sprint Bioscience에서 제공했습니다.

Sprint Bioscience는 혁신적인 종양학 프로젝트의 포트폴리오를 구축하고 있는 약물 발견 회사로, 암 대사를 집중적으로 다룹니다. 분절 기반 약물 발견 플랫폼을 갖추고 있는 Sprint Bioscience는 약품 개발에 적합한 특성을 가진 분자를 신속하게 파악할 수 있습니다. 이 분자는 약물 발견 프로그램에 대한 기반을 제공합니다. 단백질 과학, 분절 검사, 의료 화학, X선 결정학 및 관련된 생물학 연구를 포함하는 반복 공정에서 Sprint Bioscience는 분자를 개질하여 개발 공정에 도입할 약물 후보 물질을 생성합니다. 또한 Sprint Bioscience는 사내 지식과 기술 플랫폼에 접근하면서 계약 연구 서비스를 제공합니다.

참고 문헌

1. Funderburk, S.F. et al. The Beclin 1-VPS34 complex – at the crossroads of autophagy and beyond(자식 작용의 기로에 서 있는 Beclin 1-VPS34 복합체). Trends Cell Biol. 20, 355-362(2010)
2. Yang, S. et al. Pancreatic cancers require autophagy for tumorgrowth(췌장암은 종양 성장에 대한 자식 작용이 필요하다). Gene. Dev. 25, 717-729(2011)
3. Tumbull, B.W & Daranas, A.H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry?(c의 가치에 대해: 낮은 친화도 시스템은 등온 적정 열량측정법으로 연구할 수 있는가?) J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866(2003)