단백질의 순전하량은 70년 이상 측정되어 왔지만 특정 용액 조건 하에서 아직까지 확실히 밝혀지지 않은 변수입니다. 단백질의 순전하량을 측정할 수 있다고 주장하는 다양한 분석을 통해 얻어진 결과의 모호함은 단백질 구조의 변화가 포함되어 있기 때문입니다. 이러한 측정법에는 용액 성분의 분리, 용액 전처리, 단백질과 이동상과의 상호 작용이 포함되어 생성된 정보의 의미를 모호하게 합니다.
그러나 확산장벽 기법을 이용하면 전처리 없이 단백질의 이동도를 측정할 수 있습니다. 이 큐벳 기반으로 한 비분리식 방법으로 바이오약제 제제, 비교 분석, 단백질 결정화와 같이 단백질 특성을 분석해야 하는 분야에 적용하기 매우 적합합니다.
이 응용 노트에서는 BSA를 예로 들어 단백질 등전점 계산을 위한 Zetasizer Nano ZSP 사용법을 설명하고 다른 전하 측정 기법으로 얻은 데이터와 비교 할 것입니다.
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3 - 10 pH 범위와 10mM HEPES에서 Zetasizer Nano ZSP를 이용하여 5.0mg/ml BSA의 전기영동 이동도를 측정했습니다. 이러한 측정은 단백질과 전지 전극 간 접촉으로 인한 잠재적 변성 효과를 최소화하기 위해 Malvern에서 계발 및 특허를 취득하고 다른 응용 노트[1, 2]에서 자세히 설명한 확산 장벽 기법을 사용하여 측정하였습니다(그림 1).
현재 작업에 대해 획득된 데이터(그림 2에 표시)는 BSA의 등전점이 4.5 이하임을 나타냅니다. 단백질의 순전하량은 용액의 pH가 이 점에 가까워짐에 따라 감소하며, pH가 3에서 4로 증가함에 따라 전기영동 이동도의 양극성이 감소하고, pH가 7에서 5로 감소함에 따라 음극성은 감소합니다.
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서로 다른 NaCl 기반의 BSA 제형을 사용하여 다른 기법(예: 자유 유동 전기영동, 모세관 전기영동)을 사용한 결과와 동일한 기법과 장비를 사용하여 얻어지는 결과들은 거의 유사한 것을 알 수 있습니다. 모든 기법은 4.5 - 5의 등전점을 나타냅니다.
pH 7 - 10 사이에서는 Zetasizer Nano ZSP를 사용하여 HEPES 버퍼가 조건에서 얻어진 BSA의 단백질 이동도는 NaCl이 존재할 때 얻은 결과와는 반대로 음극성이 감소합니다. 이러한 반대 결과는 단백질의 구조적 변화로 인해 순 단백질 전하량이 달라 두 버퍼간 BSA 안정성이 다르기 때문일 수 있습니다. 또한, HEPES 버퍼에서 Zetasizer Nano ZSP 단백질 이동도는 NaCl에서 얻은 값에 비해 pH3 - 7 사이에서 양적으로 큽니다. 이 결과는 유기 HEPES보다 전하 차폐 효과가 큰 무기 NaCl에서 더 일관적으로 나타나며, 유기 HEPES는 앞에서 단백질 무기 상호 작용에 대한 강력한 차폐 효과를 갖는 것으로 입증되었습니다[3].
Zetasizer Nano ZSP를 사용하면 단백질의 전반적 전하 상태를 측정할 수 있어 단백질 환경과 형태의 변화에 매우 민감합니다. 다른 전하 측정 기법과 달리 단백질 이동도 측정은 분리 기법이 아니며 이동상이 필요하지 않습니다. Zetasizer Nano ZSP에서 사용하는 큐벳 기반 기법은 바이오 약제 특성 분석, 단백질 결정화와 같은 응용 분야에 측정관련 편의성 측면에서 형광 분석법, 원이색법 등의 다른 생물물리학적 방법과 함께 활용 가능합니다.
