La plupart des produits biothérapeutiques contiennent des protéines ou des dérivés de protéines et la classe la plus importante de produits biopharmaceutiques actuellement sur le marché ou en cours de développement est constituée d’anticorps monoclonaux (AcMo). Les anticorps possèdent une spécificité : ils sont capables de se fixer de manière spécifique sur un antigène, c’est pour cela que l’industrie biopharmaceutique a décidé de les utiliser pour modifier l’activité de molécules cibles particulièrement importantes sur le plan pharmaceutique dans le but de lutter contre les maladies (contrôle et prévention).
On relève toutefois une différence importante entre les petites molécules pharmaceutiques et biopharmaceutiques. En effet, ces dernières doivent être transformées et distribuées sous forme liquide. En raison de l’instabilité des protéines en solution, des méthodes doivent être développées pour que ces molécules puissent être fabriquées et conservées pendant très longtemps en solution sans être dégradées. C’est donc précisément là que les tests de stabilité des protéines se sont avérés utiles dans le développement et la fabrication de produits biothérapeutiques.
Incontestablement, les tests de stabilité en temps réel sont nécessaires pour évaluer la longévité ou la durée de conservation d'une protéine en solution. Toutefois, ces tests sont souvent chronophages, et des méthodes prédictives et rapides ont donc été établies pour accélérer le processus d’apprentissage à partir duquel des formulations stables de médicaments biologiques et des conditions de production peuvent être développées.
Les méthodes de dénaturation thermique qui contrôlent les propriétés physiques de la protéine en fonction de la température sont des méthodes prédictives utilisées très fréquemment. Grâce à l’utilisation de ces données, on est capable de déterminer les températures responsables des changements de conformation de la protéine et même de les utiliser pour des études comparatives. Les molécules qui ont besoin d’être exposées à des températures élevées pour connaître des changements de conformation sont supposées être plus stables et avoir une durée de vie plus longue. Il existe toutefois certaines exceptions importantes à cela qui seront expliquées plus loin dans ce document.
Les profils de dénaturation ou de stabilité thermique peuvent être obtenus pour différents candidats-médicaments présents dans le même tampon pour comparer la stabilité intrinsèque du produit biopharmaceutique dans des conditions définies. On appelle cette pratique la « sélection du candidat ».
Les profils de stabilité thermique peuvent être générés pour n’importe quelle molécule présente dans plusieurs tampons ou solutions de co-solutés pour pouvoir identifier les propriétés stabilisatrices et déstabilisatrices. Parmi les excipients et les additifs classiques de formulation, on trouve les acides aminés, les sucres, les glycols, les sels et les détergents. Il faudra veiller à ce que ces substances n'interfèrent pas avec les tests. Ces types de tests sont généralement réalisés par des groupes qui travaillent sur la pré-formulation ou la formulation et sur le développement de procédés. Ces tests ont pour objectif d’identifier les stratégies de purification qui suivent une série d'étapes chromatographiques et d’inactivation virale et qui permettront d’obtenir une productivité maximale du produit biopharmaceutique en déterminant la charge stable et les tampons d’élution.
Les plus quantitatives de ces techniques analytiques, comme la calorimétrie différentielle à balayage, sont également utilisées pour des études de biosimilarité et de comparabilité.
Comme indiqué précédemment, les molécules qui ont besoin d’être exposées à des températures élevées pour connaître des changements de conformation sont supposées avoir une durée de vie plus longue. Toutefois, cette « règle empirique » peut être trompeuse si la technique choisie pour observer ces changements ne réagit pas aux procédés chimiques d'inactivation ou aux événements conformationnels. C’est l’une des raisons pour lesquelles il faut envisager avec prudence l’achat de votre plateforme d’analyse de la stabilité des protéines.
Il existe un grand nombre de techniques sur le marché capables de mesurer la stabilité des protéines. Beaucoup de fabricants témoignent de la qualité des données que ces instruments génèrent en comparant les résultats à ceux obtenus par calorimétrie différentielle à balayage (DSC). La DSC est la technique d’analyse classique en fonction de laquelle ils mesurent leurs techniques, et est très appréciée dans le milieu de la biophysique. C’est pour cela que la DSC est souvent considérée comme la technique de « référence ».
Comme le disait l'un de nos clients soulignant l’importance de la DSC :
« La DSC est probablement la technique la plus performante, la plus intéressante et la plus importante de toutes les méthodes biophysiques actuellement proposées ».
Sorina Morar-Mitrica, Ph.D - GlaxoSmithKline; The BioProcessing Summit, 2012
Certes, il est toujours possible de trouver des exemples où ces techniques alternatives génèrent effectivement des données fiables, mais il faut reconnaître que dans de nombreux cas elles se sont avérées moins satisfaisantes. Évidemment, ce sont des exemples dont on entend rarement parler.
Tous les vendeurs utilisent leur propre jargon et ont différentes façons de présenter leurs instruments et leurs caractéristiques techniques. Il est important d’abord de connaitre vos besoins en termes d'utilisation et de comprendre en quoi les caractéristiques du produit peuvent influer sur les instruments. Il faut tenir compte de ces éléments lorsque vous êtes intéressés par ces instruments capables de mesurer la stabilité de votre protéine.
La plupart des vendeurs d’instruments non calorimétriques comparent directement leurs produits avec la DSC. C’est aux dépens de la reproductibilité et du contenu en information que certains de ces produits possèdent des avantages spécifiques en termes de faible consommation d’échantillons par analyse. Il ne s’agit pas d’un avantage de conserver l’échantillon lorsque les données générées peuvent induire des erreurs et entraîner une mauvaise prise de décisions. Il est très coûteux de recommencer une grande partie du projet de développement à cause d’une analyse peu précise de la stabilité de la protéine.
1.Est-ce que je souhaite utiliser cet instrument pour évaluer la stabilité de toutes les protéines ou produits biothérapeutiques candidats ?
La DSC s’applique à l’analyse de toutes les protéines, quel que soit le nombre ou la position des résidus de tryptophane présents.
Il existe d’autres outils permettant de mesurer la fluorescence intrinsèque mais ils sont utilisés de manière indirecte dans l’évaluation de la stabilité de la protéine. Ce qu’ils peuvent réellement mesurer, c’est le changement de polarité de l’environnement d’un résidu de tryptophane lorsque la protéine se dénature.
Cette démarche comprend de nombreux inconvénients. Le changement qui a lieu dans l’environnement de ce résidu d'acide aminé spécifique doit représenter la dénaturation complète de la molécule. Autrement dit, le résidu de tryptophane doit être enfoui dans le cœur de la protéine et présent au niveau de tous les domaines d’une protéine multidomaine. Malheureusement, il est peu probable que ce soit le cas. La stabilité de la structure d’un sous-domaine sans résidu de tryptophane ne sera pas mesurée, ce qui pourrait aboutir à une mauvaise formulation ou à une mauvaise sélection du candidat et par conséquent avoir des répercussions sur l'étape suivante du processus de développement. Certaines protéines ne contiennent même pas de résidus de tryptophane, c’est donc pour cela qu’elles ne peuvent pas du tout être analysées par des méthodes de fluorescence intrinsèques.
Figure 1: Thermogrammes DSC représentatifs d’un candidat biologique. Ces données mettent en évidence la dénaturation d’un anticorps sous l’effet de la chaleur dans différents tampons. Les profils montrent différents plateaux qui correspondent à la dénaturation des domaines CH2, CH3 et du fragment Fab de l’anticorps. Les solutions de formulation utilisées dans l’image du bas ont été sélectionnées en raison d’une TM élevée et d’une T1/2 faible.
2.Est-ce que je souhaite caractériser la stabilité de tous domaines présents au niveau d’une protéine multidomaine ?
Compte tenu du caractère hautement reproductible de la DSC et de sa capacité à analyser les changements de structure de la protéine, on peut l’utiliser pour mesurer avec précision la stabilité de sous-domaines particuliers. Il existe des exemples de techniques spectroscopiques qui génèrent des profils de stabilité de la protéine contenant des informations sur les sous-domaines mais, là encore, on constate que ces techniques sont incapables de fournir des données et de percevoir certains changements de structure. Cela est dû au fait que les résidus de tryptophane ne sont pas répartis parfaitement sur l’ensemble de la protéine pour être détectés par fluorescence. Certains domaines auront donc des résidus de tryptophane enfouis et d’autres n’en auront pas. Cela peut être particulièrement important si un instrument est incapable de détecter la première transition et de sélectionner correctement un candidat ou un tampon de formulation puisque les changements de structure apparus dans la protéine n’étaient pas visibles avec la technique utilisée pour les mesurer. La DSC est une technique générique mondiale de haute résolution capable de mesurer la stabilité d’une protéine et qui n’est pas affectée par ce type de problèmes.
Figure 2 : Dénaturation d’un anticorps sous l’effet de la chaleur observée par fluorescence intrinsèque. Le profil ne comporte aucune transition marquée, il n'est donc pas idéal pour déterminer la TM.
La DSC qui est utilisée pour surveiller la stabilité des sous-domaines des anticorps présente un autre avantage : la taille du domaine de liaison du fragment Fab est généralement plus grande que celle des domaines CH2 et CH3, ce qui permet de l’identifier plus facilement. L’amplitude du signal pour la plupart des techniques spectroscopiques n’est pas spécifique au domaine, il est donc primordial de savoir quel domaine est stable ou instable. Cela est particulièrement important lorsqu’il s’agit de projets concernant la fabrication des protéines et la sélection du candidat où il est essentiel de connaître quelle partie du produit biologique est affectée.
3.Est-ce que je veux que mes données soient exemptes d'artéfacts expérimentaux susceptibles d’affecter mes résultats ?
Beaucoup de méthodes avec une faible consommation d’échantillons utilisent la fluorescence pour mesurer indirectement la stabilité d’une protéine. Outre les problèmes décrits précédemment, la fluorescence souffrent de certains artéfacts et notamment de la désactivation, de l’effet de filtre interne, de l’agrégation et de la dispersion de la lumière qui généralement varient en fonction de la concentration de l’échantillon. Il en résulte deux conséquences importantes. La première est qu’il est très difficile d’obtenir des résultats reproductibles lorsque l’on compare des données sur plusieurs jours et dans différents laboratoires car le fait de veiller à ce que les co-solutés soient à des concentrations identiques est compliqué et demande beaucoup de temps. La seconde est que ces artéfacts peuvent avoir une incidence sur la forme des courbes relatives à la dénaturation, ce qui donne des résultats différents d’une analyse à l’autre, extrêmement subjectifs et dont l'interprétation correcte demande d'importantes compétences.
Certains tests spectroscopiques imposent l’utilisation de colorants pour surveiller la stabilité de la protéine. Ces tests connaissent les mêmes problèmes que la fluorescence intrinsèque, mais en plus, le colorant peut affecter la stabilité de la protéine lui-même ou un composant tampon peut avoir une incidence sur l’interaction du colorant avec la protéine. Cela peut donner des profils de stabilité qui tiennent compte de l’interaction du colorant avec la protéine, ce qui les rend plus complexes compte tenu des interférences provenant du composant tampon et n’ayant aucun rapport avec la stabilité de la protéine elle-même. Il en est de même lorsqu’il s’agit d’utiliser les profils de stabilité comme une méthode indirecte capable d’analyser de petites molécules qui se lient à des cibles médicamenteuses.
La DSC est une technique fondamentale, utilisée à l’échelle mondiale, et qui permet de mesurer la stabilité de toute la protéine. Cette technique n’est pas concernée par les limites évoquées précédemment.
4.Est-ce que je veux des données reproductibles ?
La DSC est souvent considérée comme la technique par excellence utilisée pour mesurer la stabilité d’une protéine et fournir des données hautement reproductibles. C’est pour cela que la DSC est utilisée lors des études de biosimilarité et de biocomparabilité. La DSC a été une technique décisive utilisée récemment et de manière fructueuse lors de la demande d'autorisation de mise sur le marché du médicament biothérapeutique Remsina, qui est un médicament biosimilaire au Remicade. Des chercheurs ont réalisé une étude dans les laboratoires Amgen et ont découvert que la DSC était la meilleure technique pour identifier un produit biothérapeutique qui s’était oxydé. Le succès rencontré par cette technique lors de la demande d’autorisation réside dans la capacité hautement reproductible des données de DSC et dans la capacité de la DSC à détecter de légers changements dans la structure d’ordre supérieur d’une protéine multidomaine.
La DSC fait également l’objet d’étude car on cherche à connaître son utilité en tant qu’outil diagnostique pour identifier des patients souffrant de diverses formes de cancer. Manifestement, la reproductibilité de la DSC constitue un élément important de cette étude. Voici une citation du responsable scientifique de l'équipe qui a réalisé ce travail, soulignant le caractère hautement reproductible des données de DSC pouvant être atteint grâce à l’utilisation du DSC MicroCal VP-Capillary de Malvern.
« Particulièrement appropriée pour analyser automatiquement un nombre élevé d’échantillons et réduire au minimum les erreurs humaines et accidentelles ».
« Caractérisée par une remarquable reproductibilité d’analyse et une impressionnante sensibilité à l'utilisation d’échantillons ».
« Simple à programmer avec le logiciel de contrôle ».
« Facile à entretenir grâce à la programmation de tests périodiques de contrôle et de nettoyage ».
Adrian Velazquez-Campoy - Institute BIFI - University of Zaragoza, Spain
5.Est-ce que je veux mesurer la stabilité de mon produit biologique dans une grande variété de tampon ou de co-solutés ?
Certaines techniques ont des exigences spécifiques quant à la compatibilité des tampons et/ou des co-solutés. Le dichroïsme circulaire est un bon exemple de cette limite car certains tampons comme ceux utilisés lors des études de formulation absorbent la lumière aux mêmes longueurs d’ondes que la protéine, ce qui entraîne une saturation du signal. De plus, l’utilisation même de très petites quantités de détergents, retrouvés généralement dans les tampons de formulation, est incompatible avec la plupart des techniques ayant recours à la fluorescence.
La DSC est une technique non spectroscopique qui n’est pas affectée par ces problèmes.
6.Dois-je caractériser les protéines présentant une haute stabilité thermique ?
La DSC est spécifiquement conçue pour mesurer et s’adapter aux différents niveaux de stabilité thermique des protéines mais également pour endurer des températures élevées et inférieures à la température ambiante. En revanche, les techniques spectroscopiques ne peuvent généralement pas être utilisées à des températures inférieures à 20°C ou supérieures à 90°C. La dénaturation thermique de protéines thermiquement labiles a souvent lieu à des températures inférieures à la température ambiante et peut ne pas être détectée par les techniques de spectroscopie. À l’autre bout du spectre, même si les protéines ont une TM ou un point médian de transition thermique se trouvant en dessous de 90°C, il faut en général une température de 20°C de plus pour que le point de fin puisse être déterminé précisément.
En définitive, si la TM est inférieure à 70°C, il faut utiliser la DSC pour toutes les protéines.
7.Est-ce que je veux des données simples à analyser ?
Le DSC MicroCal VP-Capillary de Malvern utilise des logiciels d’analyse automatique permettant de supprimer la subjectivité et de simplifier les connaissances techniques. Les résultats de nombreuses techniques concurrentes peuvent être subjectifs et difficiles à analyser. C’est d’autant plus évident lorsque l’on analyse des protéines multidomaines telles que les anticorps.
« La capacité d’analyse de ce système est renforcée par un logiciel facile à utiliser et qui ne demande pas de calculs manuels, ce qui nous permet de gagner du temps. Ce gain de temps a grandement amélioré notre flux de production ».
Katherine Bowers - Fujifilm Diosynth Biotechnologies
8.Est-ce que je veux détecter de légers changements dans la stabilité de ma protéine ?
La DSC est capable de détecter les changements à tous les niveaux de la structure de la protéine (primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire) ET est extrêmement reproductible. Ce qui signifie que la DSC pourra détecter même des changements minimes de TM et donc analyser la structure d’ordre supérieur.
Un des exemples les plus récents a révélé que le thermogramme DSC d’une protéine multidomaine constituait la meilleure approche pour détecter des niveaux superflus, faibles (< 5%) de produit biothérapeutique oxydé par rapport à un vaste arsenal de techniques spectroscopiques (Arthur et al, (2015) J Pharm Sci, Vol 104, 1548–1554).
9.Quelles sont les qualités du fabricant ou du fournisseur ?
Il est important d’évaluer la réputation du fabricant ou du fournisseur que vous choisissez pour être sûr d’investir dans de la qualité.
Les instruments de DSC doivent être fabriqués selon des normes exigeantes et conçus par des sociétés établies à la pointe de la technologie, capables de fournir des résultats de qualité.
Il est important de choisir un fournisseur expérimenté et capable de développer et d’optimiser ces technologies. Ces sociétés produisent des instruments présentant une bonne variabilité de type M2M et sont en général les premières à s’engager dans une démarche de progrès pour faire avancer la technologie. Elles sont davantage susceptibles de disposer de l’expertise, de l’expérience et de ressources nécessaires pour ne pas uniquement créer de bons instruments mais aussi pour leur fournir une assistance technique adéquate.
10.Que pensez-vous du service après-vente ?
L’achat d’un instrument n’est que le début d’une longue relation avec le fournisseur/fabriquant, il est donc important d'acheter un système auprès d’une société qui offre un service après-vente satisfaisant.
Il est important de choisir une société qui offre un service clientèle disponible par téléphone et par e-mail, des possibilités de formation continue, un service composé d’une équipe en lien direct avec la clientèle et un service réunissant des experts. Avant d’acheter un instrument, demandez quel genre de matériel est fourni pour que vous puissiez vous faire une idée de la qualité et du niveau du matériel qui vous attend une fois qu’il sera installé dans votre laboratoire.
Utilisation/Besoin | Système DSC MicroCal | Dichroïsme circulaire | Fluorescenceintrinsèque | Fluorescenceextrinsèque |
Générique pour toutes les protéines | Oui | Oui | Non | Non |
Sensibilité à tous les niveaux de structure de la protéine | Oui | Non | Non | Non |
Mesure quantitative directement proportionnelle à la quantité de matière se trouvant à l’état natif | Oui | Oui | Non | Non |
Test global de stabilité de haute résolution | Oui | Non | Non | Non |
Plusieurs indicateurs de mesure de la stabilité | Oui | Non | Non | Non |
Identification du profil de dénaturation | Oui | Non | Non | Non |
Exempt d'aberrations optiques | Oui | Non | Non | Non |
Hautement reproductible | Oui | Non | Non | Non |
Plus besoin de colorants, de marqueurs ou d'additifs chimiques | Oui | Oui | Oui | Non |
Exempt d'interférences entre tampon et co-soluté | Oui | Non | Non | Non |
Mesure des TM supérieures à 70°C | Oui | Non | Non | Non |
Mesures idéales de la TM | Oui | Non | Non | Non |
Le tableau ci-dessus illustre clairement la raison pour laquelle la DSC est énormément utilisée au sein de l’industrie biopharmaceutique et considérée comme la référence absolue pour mesurer la stabilité d’une protéine. Cette affirmation est étayée dans un article récent qui décrit en détail les réponses données par plusieurs professionnels de l'industrie biopharmaceutique lorsqu’il leur est demandé de classer par ordre d’importance les techniques appliquées dans le cycle de développement biopharmaceutique (Gabrielson and Weiss IV (2015), Journal of Pharmaceutical Sciences 104:1240–1245). Les techniques étaient utilisées et appliquées aussi bien pour sélectionner un candidat ou développer une formulation que pour évaluer la comparabilité et la biosimilarité.
Il est évident que la DSC est la technique la plus adaptée universellement pour évaluer la stabilité de produits biologiques.
Même si certaines techniques non spectroscopiques ont une plus faible consommation d’échantillons que la DSC, elles sont souvent inadaptées à cette pratique en raison de faiblesses inhérentes, notamment les interférences entre colorants, la dispersion, l’effet de filtre interne, un signal faible ou inexistant et le manque d’information sur la structure des sous-domaines.
Bon nombre de ces failles et incompatibilités peuvent entraîner des décisions malavisées et très coûteuses pouvant conduire à des projets de redéveloppement et/ou à la non développabilité d’un médicament biologique.
Le DSC MicroCal de Malvern fournit d’excellentes données de stabilité reproductibles et exemptes d’artéfacts pour chaque protéine présente dans chaque tampon.
