Cinétique de liaison d'un RCPG

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) comprennent une grande classe de protéines membranaires intégrales, essentielles à la transduction de stimuli extracellulaires à travers la membrane plasmique afin d'obtenir des réponses moléculaires et cellulaires. Ils régulent une variété de processus physiologiques chez les eucaryotes et représentent le plus grand groupe de cibles thérapeutiques, avec plus de 30 % des produits pharmaceutiques disponibles ciblant les RCPG.

Les protéines membranaires sont notoirement difficiles à étudier en raison de la nécessité d'un environnement imitant la membrane et de leur instabilité une fois extraites d'une membrane cellulaire. Dans cette note technique, nous soulignons la capacité du Creoptix WAVE à mesurer l'interaction d'un agoniste de ligand peptidique (NTA11) avec un variant thermostabilisé du récepteur de la neurotensine 1 (NTSR1)¹ à la résolution la plus élevée. Ce RCPG intervient dans les multiples fonctions de la neurotensine, telles que l'hypotension, l'hyperglycémie, l'hypothermie, l'antinociception et la régulation de la motilité et de la sécrétion intestinales².

Matériels et méthodes

Le récepteur a été biotinylé in vivo via une Avi-tag et capturé sur un capteur prérecouvert de streptavidine (WAVEchip DXH-STA). Dans le cas de l'agoniste peptidique mesuré, une forme mutée et tronquée de neurotensine (MM 725 Da), comprenant les résidus 8-13 avec une substitution Y11A, a été utilisée. Des courbes de dose-effet ont été enregistrées pour 7 concentrations différentes d'analyte d'une série de dilutions 3 fois, 300 nM étant la concentration la plus élevée. Le débit a été réglé sur 30 μl/min. Le tampon de migration était composé de 5 0 mM de Tris, à un pH de 7,5, de 150 mM de NaCl et de 0,1 % (p/v) du détergent lauryl maltose-néopentylglycol (L-MNG)³. Toutes les mesures ont été réalisées à 25 °C.

Résultats

Un récepteur de neurotensine purifié et biotinylé a été capturé sur un capteur prérecouvert de streptavidine (WAVEchip DXH-STA) à une densité de 1 350 pg/mm². Des courbes de dose-effet pour la liaison de l'agoniste peptidique ont été enregistrées (figure 1), donnant des données de liaison qui pourraient être bien ajustées avec un modèle pour une interaction 1:1 comprenant un terme pour le transport de masse (MTL). Les taux cinétiques et la constante d'équilibre obtenus sont résumés dans le tableau 1.

Figure 1 : sensorgrammes de l'interaction entre un peptide de neurotensine modifié (MM 725 Da) comme analyte et un récepteur de neurotensine thermostabilisé (NTSR1, complexe protéine/détergent de 70 kDa) comme ligand. Les données ont été ajustées à l'aide d'un modèle pour une interaction 1:1 comprenant un terme pour la limitation du transport de masse (MTL) avec le logiciel WAVEcontrol

Tableau 1 : taux cinétiques et constante de dissociation pour l'agoniste NTA11 obtenus avec un modèle d'interaction 1:1 comprenant un terme pour la limitation du transport de masse (MTL)

Références

1. Egloff, P., Hillenbrand, M., Klenk, C., Batyuk, A., Heine, P., Balada, S., Schlinkmann, K. M., Scott, D. J., Schütz, M., et Plückthun, A. (2014) Structure of signaling-competent neurotensin receptor 1 obtained by directed evolution in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, E655–62.
2. Krumm, B. E., et Grisshammer, R. (2015) Peptide ligand recognition by G protein-coupled receptors. Front. Pharmacol. 
3. Chae, P. S., Rasmussen, S. G. F., Rana, R. R., Gotfryd, K., Chandra, R., Goren, M. a, Kruse, A. C., Nurva, S., Loland, C. J., Pierre, Y., Drew, D., Popot, J., Picot, D., Fox, B. G., Guan, L., Gether, U., Byrne, B., Kobilka, B., et Gellman, S. H. (2010) Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nat. Methods 7, 1003–1008.