Criblage de mélanges réactionnels bruts

Introduction

Le criblage des fragments est apparu comme une approche efficace pour identifier les premiers hits dans le processus de recherche de médicaments. La caractéristique centrale est qu'un petit nombre (des milliers) de composés de faible masse moléculaire (généralement < 250 Da) sont criblés pour se lier à une cible. La petite taille des composés signifie qu'ils sont plus susceptibles de se lier, mais avec une faible affinité, et de nombreuses approches biophysiques différentes peuvent être utilisées, y compris les capteurs Creoptix. Il est relativement simple d'identifier les fragments qui se lient à la plupart des sites de liaison sur la majorité des cibles. Le défi consiste à faire croître les fragments jusqu'à obtenir des hits plus importants à plus forte affinité avant de commencer à optimiser les propriétés des médicaments.

L'affinité pour un composé (analyte, A) se liant à une cible (ligand, L) suppose un équilibre simple comme suit :

où k_d correspond à la dissociation ou au taux de dissociation et k_a à l'association ou au taux d'association et la constante de dissociation à l'équilibre, ou affinité, (K_D) représente le rapport k_d / k_a. Dans de nombreux cas, des améliorations de l'affinité se produisent lorsque les modifications apportées au composé entraînent un ralentissement du taux de dissociation. Il s'agit d'une constante de taux de premier ordre, qui est donc indépendante de la concentration.

Les approches conventionnelles d'optimisation nécessitent des réactions individuelles afin de synthétiser chaque composé, puis une purification et une préparation du composé à une concentration définie avant de mesurer l'affinité dans un dosage. Vernalis a été la première entreprise à lancer une approche dans laquelle les mélanges réactionnels bruts (CRM) sont criblés, ce qui améliore considérablement la vitesse et le coût de la synthèse pour explorer les possibilités d'amélioration de l'affinité des composés. Dans le cas d'un hit, un ensemble de réactions est effectué en parallèle, généralement dans un format de plaque, modifiant le ou les substituants incorporés dans le hit. Après une préparation minimale, les mélanges réactionnels bruts obtenus sont ensuite évalués individuellement pour déterminer les changements au niveau du taux de dissociation de la liaison à la cible. Un changement du taux de dissociation indique qu'un composé de meilleure affinité a été obtenu. La démonstration initiale d'un tel criblage du taux de dissociation (ORS)¹ a utilisé la technologie Biacore pour mettre en évidence des améliorations d'efficacité en matière de matériel, d'élimination des déchets associés et de temps. En outre, il est possible de classer rapidement un plus grand nombre de composés aux premiers stades d'un projet, lorsque la compréhension des relations structure-activité (SAR) est potentiellement faible.

La capacité de détecter de manière fiable les changements de taux de dissociation est essentielle à cette approche. La technologie exclusive d'interférométrie couplée à un réseau (GCI) offre une sensibilité supérieure à celle des technologies traditionnelles, comme la résonance plasmonique de surface (SPR), ce qui permet de déterminer de manière fiable des taux de dissociation allant jusqu'à 10 s^-1. De plus, la technologie microfluidique sans obstruction du Creoptix WAVE permet une grande variété de solvants, y compris l'acétonitrile et des concentrations élevées de DMSO, ce qui augmente la gamme de constituants chimiques pouvant être utilisés dans les mélanges réactionnels bruts.

Dans cette note technique, nous avons comparé les résultats de l'ORS obtenus avec le Creoptix WAVE à ceux obtenus précédemment par Vernalis avec l'instrument Biacore, en utilisant rétrospectivement la même bibliothèque de CRM par rapport à deux cibles, la pyruvate déshydrogénase kinase 2 (aa16-407), ci-après désignée PDHK2 et le domaine ATPase N-terminal de la protéine de choc thermique 90α (aa9–236), ci-après désignée HSP90. Vernalis a déjà identifié une série d'inhibiteurs puissants pour ces deux membres de la famille GHKL des ATPases.^2,3,4

Matériels et méthodes

Criblage du taux de dissociation de mélanges réactionnels bruts (CRM). Quatre-vingt-trois (83) CRM et un composé témoin purifié ont été criblés pour leurs taux de dissociation sur le WAVEdelta. Une puce WAVEchip PCH-NTA a été chargée de chlorure de nickel avant de capturer les protéines cibles. Les protéines HSP90 et PDHK2 doublement marquées à l'histidine 6 ont ensuite été capturées à env. 7 000 pg/mm² sur les canaux 2 et 3 respectivement. Les canaux 1 et 4 ont été chargés de nickel et utilisés comme canaux de référence. Les CRM ont été injectés à une concentration d'environ 20 μM dans du HBS-P et du DMSO à 1 % pendant 30 s à un débit constant de 250 μl/min. La dissociation a été autorisée pendant 120 s. La détermination du taux de dissociation a été effectuée à l'aide du logiciel WAVEcontrol.

Cinétique du composé purifié

Une puce WAVEchip PCH-NTA a été chargée avec 0,5 mM de NiCl² avant la capture des protéines. Les protéines HSP90 et PDHK2 ont été capturées dans le tampon HBS-P à une densité d'environ 3 500 pg/mm2. Du VER235377 (composé purifié) a été injecté à 30 μl/min dans du HBS-P et du DMSO à 1 % à des concentrations croissantes allant de 27,4 nM à 20 μM (7 concentrations, dilutions 3 fois). L'injection a été autorisée pendant 60 s avant une phase de dissociation de 60 s. Toute l'analyse des interactions a été effectuée à 25 °C et les données ont été évaluées à l'aide du WAVEcontrol. Un modèle de Langmuir 1:1 a été utilisé pour l'ajustement des données et les paramètres cinétiques ont été déterminés.

Résultats

Vernalis a été la première entreprise à utiliser le criblage du taux de dissociation (ORS) pour l'échantillonnage cinétique dans l'espace chimique du « hit-to-lead ».¹ Son expertise en matière de chimio-informatique, de synthèse de bibliothèques de composés et d'analyse par résonance plasmonique de surface (SPR) s'est avérée intéressante pour cette étude de référence et a permis l'ORS de produits de réaction non purifiés (CRM). Le criblage de CRM identifie rapidement les leads à partir de fragments hits sans purification des bibliothèques de composés ni utilisation de la structure des protéines. Une étude comparative de l'ORS a été réalisée en utilisant le WAVEdelta (basé sur la technologie GCI) et le Biacore T200 (basé sur la technologie SPR) pour comparer et contraster les deux technologies. Plus précisément, des composés sélectionnés ont été mesurés sur le WAVEdelta et comparés à une bibliothèque de CRM Vernalis testée rétrospectivement (sur un Biacore T200). 

La figure 1 présente des exemples de détermination du taux de dissociation de CRM sélectionnés. Dans les deux expériences, les résultats obtenus avec le Creoptix WAVEdelta étaient en accord avec ceux obtenus avec le Biacore T200. Pour les composés dont les taux de dissociation sont supérieurs à 1 s^-1, le WAVEdelta a pu résoudre de manière fiable ces constantes de dissociation très rapides (k_off).

Figure 1 : criblage du taux de dissociation de certains CRM. Les mesures ont été effectuées soit sur un Biacore T200 (panneau de gauche), soit sur un Creoptix WAVEdelta (panneau de droite). Les données de GCI reproduisent les données de SPR et permettent de déterminer de manière précise et plus fiable le taux de dissociation des interactions plus rapides que 1 s^-1

Cette étude de criblage du taux de dissociation a mené à l'identification du même hit sélectif de PDHK2 qui a également été caractérisé comme composé purifié (VER235377) sur le WAVEdelta. Les paramètres cinétiques et l'affinité de liaison étaient semblables à ceux obtenus par le Biacore T200 basé sur la SPR. La figure 2 présente les données obtenues par GCI (Creoptix WAVEdelta, panneaux de droite) et SPR (Biacore T200, panneaux de gauche). Enfin, nous avons identifié le même hit sélectif de PDHK2 (VER235377).^2,4 Les données cinétiques obtenues sont indiquées dans le tableau 1.

	kon (M-1.s-1)	koff (s-1)	Rmax (pg/mm2)	KD (nM)
HSP90 Biacore T200	1,92 x 105	0,130	24,1	679
HSP90 WAVEdelta	1,82 x 105	0,122	25,2	669
PDHK2 Biacore T200	6,10 x 105	0,116	18,3	191
PDHK2 WAVEdelta	3,16 x 105	0,052	14,5	166

Tableau 1 : données cinétiques du composé purifié VER235377 sur les protéines HSP90 et PDHK2

Figure 2 : données de cinétique de liaison du composé purifié VER235377. Les mesures ont été effectuées soit sur un Biacore T200 (panneau de gauche), soit sur un Creoptix WAVEdelta (panneau de droite). Des données comparables ont été obtenues pour les protéines HSP90 et PDHK2

En résumé, grâce au Creoptix WAVE, nous avons pu :

• confirmer les résultats précédemment rapportés et mesurés avec un hit de PDHK2 sur le Biacore T200^2,4 ;
• confirmer le même hit sélectif de PDHK2 VER235377 et le caractériser dans sa forme entièrement purifiée ;
• confirmer la sélectivité de PDHK2 du VER235377 sur la protéine HSP90 ;
• montrer une excellente résolution pour des composés dont les taux de dissociation sont bien supérieurs à 1 s^-1, mettant ainsi en évidence la capacité du Creoptix WAVE à résoudre les taux de dissociation rapides.

Conclusion

Le Creoptix WAVE donne des données cinétiques en parfait accord avec les mesures du Biacore T200, comme le montrent les résultats obtenus pour une campagne Vernalis de composés mesurés rétrospectivement par rapport à la pyruvate déshydrogénase kinase 2 (PDHK2) et à la protéine de choc thermique 90 (HSP90). Grâce à sa sensibilité élevée et à sa capacité de résoudre des interactions extrêmement rapides, le Creoptix WAVE améliore le criblage des composés et l'analyse cinétique des petites molécules afin d'accélérer le développement de médicaments et de réduire considérablement les coûts associés à la purification des cibles et des composés. Le WAVE est donc idéal pour le criblage des bibliothèques de liants faibles qui affichent des taux de dissociation très rapides, comme les petites molécules, les fragments, les peptides, etc. Associé à une technologie microfluidique sans obstruction qui permet l'étude de mélanges réactionnels bruts et non purifiés, le WAVE révolutionne et accélère le processus de recherche de médicaments.

Principaux points à retenir

Capturez le taux de dissociation rapide des composés à faible liaison dans des mélanges réactionnels bruts avec le Creoptix WAVEsystem.

• Technologie microfluidique sans obstruction compatible avec les mélanges réactionnels bruts : idéal pour le criblage du taux de dissociation et la conception de médicaments à base de fragments
• Données comparables aux données historiques de SPR : la technologie GCI fournit des données cinétiques semblables à celles obtenues avec les instruments basés sur la SPR
• Taux de dissociation bien résolus supérieurs à 1 s^-1 : avec une transition rapide, le WAVEsystem mesure des taux de dissociation allant jusqu'à 10 s^-1

Idéal pour :

• le criblage du taux de dissociation de mélanges bruts : petites molécules, fragments et peptides ;
• une progression rapide du « hit-to-lead » ;
• l'optimisation des leads.

Références

1. Murray, J.B. et al. 2014. Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance. An efficient method to kinetically sample hit to lead chemical space in unpurified reaction products. J. Med. Chem. 57, 2845-1850 doi: /10.1021/jm401848a
2. Brough, P.A. et al. 2017. Application of Off-Rate Screening in the Identification of Novel Pan-Isoform Inhibitors of Pyruvate Dehydrogenase Kinase. J. Med. Chem., 60, 6, 2271–2286. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01478
3. Brough, P. A. et al. 2009. Combining hit identification strategies: fragment-based and in silico approaches to orally active 2-aminothieno[2,3-d]pyrimidine inhibitors of the Hsp90 molecular chaperone. J. Med. Chem. 52, 4794–4809 doi: 10.1021/jm900357y
4. Baker, L .M. et al. Rapid optimization of fragments and hits to lead compounds from screening of crude reaction mixtures. Commun Chem 3, 122 (2020).doi: 10.1038/s42004-020-00367-0

Remerciements

Nous remercions le Dr Natalia MATASSOVA (Vernalis) pour avoir effectué toutes les expériences, ainsi que le Pr Roderick HUBBARD, pour leur contribution à cette note technique.