L'analyse biophysique des bibliothèques de composés pour l'identification des ligands interagissant avec une protéine est efficace, mais ne révèle généralement pas si (ou comment) les ligands peuvent interférer avec ses propriétés fonctionnelles. Pour cela, un essai biochimique/fonctionnel est nécessaire. Mais pour les protéines dont la fonction dépend d'un changement conformationnel, ces essais sont généralement complexes ou ont un faible rendement.
Nous avons exploré ici un biocapteur de génération de second harmonique (SHG) à haut rendement pour détecter les fragments induisant des changements conformationnels lors de la liaison à une protéine en temps réel et identifier les régions dynamiques. Plusieurs essais SHG au format de plaque multipuits ont été mis au point pour des mutants de type sauvage et six mutants de cystéine simple modifiés de protéine de liaison de l'acétylcholine (AChBP), un homologue des canaux ioniques sensibles à un ligand (LGIC). Ils ont été conjugués à un marquage actif de second harmonique par couplage d'amine ou de maléimide.
L'analyse biophysique des bibliothèques de composés pour l'identification des ligands interagissant avec une protéine est efficace, mais ne révèle généralement pas si (ou comment) les ligands peuvent interférer avec ses propriétés fonctionnelles. Pour cela, un essai biochimique/fonctionnel est nécessaire. Mais pour les protéines dont la fonction dépend d'un changement conformationnel, ces essais sont généralement complexes ou ont un faible rendement.
Nous avons exploré ici un biocapteur de génération de second harmonique (SHG) à haut rendement pour détecter les fragments induisant des changements conformationnels lors de la liaison à une protéine en temps réel et identifier les régions dynamiques. Plusieurs essais SHG au format de plaque multipuits ont été mis au point pour des mutants de type sauvage et six mutants de cystéine simple modifiés de protéine de liaison de l'acétylcholine (AChBP), un homologue des canaux ioniques sensibles à un ligand (LGIC). Ils ont été conjugués à un marquage actif de second harmonique par couplage d'amine ou de maléimide.
Pour valider l'essai, il a été confirmé que les changements conformationnels induits dans l'AChBP par les agonistes et les antagonistes des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR) étaient qualitativement différents. Une bibliothèque de 1 056 fragments a ensuite été analysée en fonction de tous les variants, tandis que les modulateurs conformationnels de l'AChBP ont été identifiés avec succès, avec des taux de rappel de 9 à 22 %, selon le variant de l'AChBP. Un sous-ensemble de quatre résultats a été sélectionné pour la validation orthogonale et l'analyse structurelle. Un essai de biocapteur à base d'interférométrie couplée au réseau à résolution temporelle a confirmé qu'il s'agissait d'une interaction réversible 1 : 1 en une étape, et a fourni des estimations des affinités et des constantes de vitesse cinétique de l'interaction (KD = 0,28 - 63 μM, ka = 0,1 - 6 μM-1 s-1, kd = 1 s-1). La cristallographie aux rayons X de deux des fragments a confirmé leur liaison à un site dynamique décrit précédemment de façon conformationnelle, correspondant au site de régulation des LGIC.
Ces résultats révèlent que la SHG possède la sensibilité nécessaire pour identifier les fragments qui induisent des changements conformationnels dans une protéine. Une sélection de résultats de fragments avec un profil de réponse différent des régulateurs de LGIC connus a été caractérisée et confirmée pour se lier à des régions dynamiques de la protéine.
