Accélération du développement de formulations de protéines thérapeutiques optimisées grâce à la calorimétrie différentielle à balayage

Les biomolécules à usage thérapeutique doivent être stabilisées sous leur forme active, native, jusqu'à l'administration au patient, et leur distribution au site d'action. Un criblage de la stabilité des formulations biopharmaceutiques à une phase précoce aide à s'assurer que les investissements ultérieurs sont affectés aux composés possédant le meilleur potentiel en termes de développement d'un médicament. La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une technique qui peut être utilisée pour déterminer rapidement les conditions optimales d'une solution en termes de stabilité de la formulation de protéine, et qui aide à identifier les meilleures formulations candidates et à en accélérer le développement. Cette note d'application décrit la technologie MicroCal DSC de Malvern et son utilisation pour le développement de formulations. 

Introduction

L'une des décisions qui doit être prise tôt dans le développement d'une substance biopharmaceutique consiste à décider si la substance sera fournie sous forme liquide, ou sous forme d'une poudre lyophilisée. En général, les formulations liquides reviennent moins cher à fabriquer et sont plus simples d'utilisation, mais elles doivent être stockées à basse température et tendent à être moins stables. Les protéines lyophilisées reviennent plus cher à fabriquer et doivent être remises en solution avant administration au patient, mais elles peuvent être stockées à température ambiante et leur stabilité est parfois meilleure. La commodité pour l'utilisateur final est également un facteur à prendre en compte (1, 2). Le formulateur doit déterminer si la protéine peut rester stable en solution pendant une durée suffisante, ou ne peut rester stable que sous sa forme lyophilisée.

En solution aqueuse, une protéine est en équilibre entre sa conformation native (repliée) et sa forme dénaturée (dépliée). Les interactions hydrophobes et les liaisons hydrogène sont les principales forces stabilisatrices, et celles-ci doivent être surpassées pour qu'une protéine se déplie et soit dénaturée. L'entropie de conformation affaiblit les forces stabilisatrices, et permet le dépliement du biopolymère (3). Les protéines se déplient sous l'effet du chauffage ou en présence de substances chimiques dénaturantes (comme le dodécyl sulfate de sodium et le chlorhydrate de guanidine). Les protéines dénaturées tendent à être plus sensibles (4-7) aux processus chimiques irréversibles tels que la protéolyse (8), l'oxydation (9), et la désamidation (10), lesquels peuvent conduire à une inactivation. Une protéine dénaturée a également plus tendance à s'agréger, et l'agrégation peut de même conduire à une perte de stabilité et à une rupture de la protéine (11-14).

Préalablement au développement d'une formulation, la protéine doit être caractérisée. Ceci peut inclure une détermination de sa masse moléculaire, de sa composition en termes d'acides aminés, de sa structure tridimensionnelle, de la présence de ponts disulfure, de la glycosylation, de la présence nécessaire de cofacteurs, d'inhibiteurs, de sa solubilité, de ses paramètres thermodynamiques, de sa fonctionnalité, de son point isoélectrique, de son hydrophobie et de sa surface spécifique. Toutes ces informations ont leur importance pour la conception de la formulation optimale de la protéine. En utilisant une approche rationnelle de la conception des médicaments, les protéines modifiées par bioingénierie peuvent également être conçues pour présenter, dans la solution retenue, la stabilité maximale et la plus grande efficacité.

Une formulation liquide de protéine doit favoriser la préservation de la stabilité et de la bioactivité du biopolymère pendant la production, le conditionnement, le stockage et l'expédition, jusqu'à l'administration finale au niveau du site cible du patient. Les paramètres à prendre en compte lors du développement d'une formulation incluent la concentration de la protéine, la présence d'additifs (excipients), le pH, la température de stockage, le récipient, l'exposition à la lumière, à l'air et à l'humidité.

Un autre facteur du développement d'une formulation implique le mécanisme d'administration du médicament. Par exemple, une substance biopharmaceutique administrée par voie intraveineuse doit pouvoir être diluée, et si la protéine est peu soluble, celle-ci risque de précipiter dans le sang du patient. De plus, si le médicament est injecté, la composition de la formulation ne doit pas provoquer de détérioration des tissus, ni de gêne pour le patient. Une considération supplémentaire est l'adsorption potentielle de la protéine sur la surface du récipient ou d'un dispositif (seringue, pompe, etc.).

La stabilité d'une protéine est généralement déterminée par différentes méthodes analytiques, dont des études de stabilité accélérées et en temps réel. L'étendue de l'agrégation/de la précipitation, de l'oxydation, de la dégradation protéolytique, et/ou de la redistribution des ponts disulfures est généralement également évaluée. Les conditions d'expédition sont testées pour s'assurer que le médicament peut être livré sans perte de bioactivité.

DSC et développement de formulation

La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une technique de microcalorimétrie utilisée pour caractériser la stabilité d'une biomolécule directement sous sa forme native. Cette caractérisation exploite la mesure de la variation de chaleur associée à la dénaturation thermique de la molécule lorsque celle-ci est chauffée à taux constant. La mesure du point médian (T_m) de la transition thermique donne une indication simple et rapide de la stabilité. Plus la T_m est élevée, plus la biomolécule est stable.

Un instrument de DSC comporte une cellule d'échantillon contenant la biomolécule dans un tampon, et une cellule de référence qui ne contient que le tampon. Des éléments chauffants sont alimentés pour augmenter la température des cellules à un taux constant. Pendant cette augmentation de température, l'instrument surveille la différence de température entre les cellules de référence et d'échantillon. La différence de chaleur absorbée entre les cellules, nécessaire pour maintenir égales les températures des deux cellules, détermine l'excès apparent de capacité calorifique (figure 1). Le point médian de température (T_m) associée au changement d'enthalpie survient lors de la transition de la protéine de sa forme native à une forme dénaturée. En supposant une transition à deux états, à T_m, 50 % de la protéine est à l'état natif, et 50 % à l'état dénaturé (figure 1). Certaines protéines, qui comportent des régions d'activité différentes ou plusieurs domaines structuraux, peuvent présenter plusieurs T_m. Le chercheur peut se concentrer sur la ou les deux valeurs de T_m qui montrent les plus grands effets lors des changements de formulation.

La T_m est un indicateur de la thermostabilité, et, en général, plus la T_m est élevée, plus la protéine est stable. Lorsque sa T_m est élevée, une protéine est aussi moins susceptible de se déplier ou de se dénaturer à une température plus basse. À travers l'étude de différentes conditions et de différents additifs, la DSC peut déterminer les formulations dont la T_m est la plus élevée, qui correspondront aux formulations optimales en termes de stabilité (4, 5, 7, 15, 16).

Durant un processus chimique, de la chaleur est soit libérée (exothermique) soit absorbée (endothermique). La transition d'une protéine de l'état natif à un état dénaturé est généralement endothermique. La variation d'enthalpie (∆H) associée au changement de conformation est mesurée par intégration de la surface sous la transition (figure 1). La capacité calorifique (C_p) de la protéine dénaturée est généralement supérieure à celle de la protéine native, ce qui se traduit par un ∆C_p positif pour la dénaturation thermique (figure 1).

Figure 1 : Thermogramme DSC type. Cette courbe DSC a été réalisée sur une solution de protéine diluée, la protéine subissant une transition depuis un état compact, natif à basse température vers un état déplié, dénaturé à haute température. L'excès apparent de capacité calorifique de la protéine a été mesuré à partir de la différence entre la capacité calorifique de la protéine dans un tampon et du tampon seul. La Tm, ∆H et ∆Cp de la transition sont calculés en ajustant les données sur un modèle de transition à deux états, en utilisant une analyse par régression des moindres carrés non linéaire.

Les systèmes MicroCal™ VP-Capillary DSC (figure 2) et MicroCal VP-DSC de Malvern sont utilisés pour l'étude des biopolymères en solution. Le système MicroCal VP-Capillary DSC de Malvern est spécifiquement conçu pour le criblage de T_m de différentes formulations à haut débit (jusqu'à 50 échantillons par 24 h), avec un taux de balayage rapide (jusqu'à 250 °C/h). Un passeur automatique d'échantillons totalement intégré permet un fonctionnement autonome. Voir le tableau 1 pour une comparaison des caractéristiques des systèmes MicroCal VP-Capillary DSC et MicroCal VP-DSC de Malvern.

Figure 2 : Système MicroCal VP-Capillary DSC de Malvern.

Stratégies pour une formulation liquide

Lors du développement d'une formulation, le problème principal est de trouver les conditions de la solution qui stabilisent le mieux la protéine à l'état natif. Les conditions qui conduisent à la T_m la plus élevée permettent généralement de conserver la protéine dans son état natif le plus longtemps, aux températures plus basses également. La DSC permet de cribler dans un premier temps les différentes conditions de pH et de tampon, avant de cribler les excipients et les conservateurs.

Optimisation du tampon et du pH

Sur la figure 3, la T_m de la protéine CD40L a été reportée en fonction du pH. L'agrégation de la CD40L a également été déterminée après incubation à 37 °C pendant 7 jours. L'optimum de T_m est corrélé aux conditions de pH dans lesquelles l'agrégation a été minimisée (16). Cette corrélation entre pH, T_m et agrégation a également été observée avec un facteur de stimulation d'une colonie de macrophage (4).

Figure 3 : Corrélation entre l'évolution de la stabilité du ligand CD40 (CD40L) en fonction du pH, à travers (A) le taux d'agrégation déterminé par chromatographie d'exclusion stérique (SEC), et (B) la Tm déterminée par DSC. La zone mise en exergue représente la plage de pH optimale, dans laquelle la Tm est maximale et l'agrégation est minimale. Tiré de la référence (16).

La mesure des changements de la T_m des protéines, par DSC, est un processus relativement simple. La figure 4 montre les changements de la T_m du chymotrypsinogène avec l'augmentation du pH, mesurée à l'aide du MicroCal VP-Capillary DSC de Malvern. La T_m augmente avec l'augmentation du pH, ce qui indique une plus grande stabilité de la forme native du chymotrypsinogène aux pH les plus élevés.

Figure 4 : Décalage de la Tm du chymotrypsinogène avec le pH. Les solutions de chymotrypsinogène (pH 1,96, 2,27, 2,57, et 3,02) ont été préparées et placées sur une plaque à 96 puits. Cinq échantillons ont été utilisés pour chaque pH. Les tampons de référence correspondants ont également été placés dans la plaque à 96 puits. Des analyses DSC ont été réalisées avec le MicroCal VP-Capillary DSC de Malvern. Les données de DSC représentées ici ont été obtenues après soustraction de l'analyse du tampon de référence. L'encart donne les valeurs de Tm pour chaque pH, ainsi que l'écart type.

Excipients

Les excipients sont des additifs pouvant améliorer la stabilité de la protéine. Il s'agit de sucres, d'acides aminés, d'antioxydants, de polymères, d'alcools, de glycérol, et de tensioactifs.

Une fois le pH et le tampon optimaux identifiés, différents excipients sont ajoutés à la solution de protéine. Si un excipient augmente la T_m, la forme native de la protéine est plus stable avec l'excipient que sans lui.

Un criblage des excipients a été utilisé pour le développement d'une formulation liquide du récepteur de l'interleukine-1, IL-1R (5). L'IL-1R a montré deux transitions principales, l'une de T_m proche de 48 °C et l'autre proche de 66 °C. La transition dont la T_m est la plus basse a été retenue pour le criblage des excipients. La stratégie consistait à rechercher les excipients provoquant un augmentation de la T_m de la transition apparaissant à la température la plus basse, qui indique une évolution positive de la stabilité de la protéine native. Vingt-trois excipients ont été criblés (tableau 2).

Force ionique

La force ionique du tampon est ajustée pour déterminer s'il est possible d'augmenter la T_m en ajoutant un sel. Pour l'IL-1R, le plus fort effet stabilisateur a été obtenu avec l'addition de NaCl à 100 mM, pour une force ionique modérée, qui a décalé la T_m de 48 °C à 53 °C. Cet effet stabilisateur suggère une interaction directe entre les ions du sel et les groupes chargés de la protéine (5). La T_m de l'IL-1R continue à augmenter avec l'augmentation de la concentration en sel, même avec 1500 mM de NaCl, bien au-delà de la concentration nécessaire pour saturer tous les sites chargés (figure 5). Ces données suggèrent que les ions du sel affectent la structure de l'eau, laquelle joue également un rôle dans la stabilité de la conformation de la protéine. La structure native de l'IL-1R est stabilisée à la fois par des interactions charge-charge et par des changements de la structure de l'eau.

Figure 5 : Tracé montrant l'évolution de la Tm de l'IL-1R en fonction de l'addition de NaCl. La concentration de 100 mM est indiquée par une ligne en pointillé. Tiré de la référence (5).

Conservateurs

Quand un médicament est fourni dans un format multidose, des conservateurs sont ajoutés pour éviter tout développement microbien. Ces conservateurs peuvent toutefois avoir un effet déstabilisateur sur la protéine. L'effet des conservateurs sur la T_m de l'IL-1R a également été étudié (5). Au vu du décalage des deux températures de transition vers les valeurs basses (tableau 3), les conservateurs méta-crésol, phénol et alcool benzylique déstabilisent l'IL-1R. Les données de DSC ont permis de déterminer l'ordre de stabilité de l'IL-1R en présence des trois conservateurs : le phénol a conduit à la T_m la plus élevée, suivi du méta-crésol puis de l'alcool benzylique. Les données de stabilité obtenues par DSC sont de plus corrélées avec l'agrégation de l'IL-1R, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Plus la T_m est élevée, moins l'agrégation a été importante après sept et soixante jours.

Les meilleurs candidats pour la formulation, sur la base du criblage de T_m, ont ensuite été évalués à travers des études de stabilité accélérées. La protéine est préparée dans différentes formulations, et stockée à 37 °C. Le taux d'agrégation est déterminé par chromatographie d'exclusion stérique à différents intervalles durant l'étude de stabilité accélérée, et la protéine est analysée par SDS-PAGE pour vérifier s'il y a eu protéolyse.

Enfin, les meilleures formulation candidates subissent une étude de stabilité en temps réel pour déterminer la durée de conservation de la protéine. Des dosages biologiques et des tests analytiques sont réalisés durant toute l'étude pour s'assurer que la protéine reste active et viable.

La DSC est utilisée depuis de nombreuses années comme un outil de criblage pour évaluer la stabilité de la protéine lors du développement d'une formulation, et l'utilisation du MicroCal VP-Capillary DSC automatique de Malvern permet un criblage plus rapide avec un débit accru par rapport au MicroCal VP-DSC (tableau 1). Le MicroCal VP-Capillary DSC de Malvern a été utilisé pour déterminer la T_m de protéines à différents pH et en présence de différents excipients, et la variation de la T_m est corrélée aux données de SEC, ce qui soutient l'utilisation de la DSC comme outil de criblage de la stabilité (17).

Résumé

Les données de DSC sont utiles pour prédire la stabilité d'une protéine en solution. La T_m est une indication de la thermostabilité, et la détermination de la T_m dans différentes formulations est une mesure approximative de la sensibilité à l'agrégation et aux autres changements irréversibles à des températures plus basses. Les formulations présentant la meilleure thermostabilité sont retenues pour les études ultérieures de stabilité, de conservation et d'expédition. L'utilisation de la DSC permet de gagner du temps et de faire des économies lors du développement de formulations, et les systèmes totalement automatisés permettent de gagner en efficacité et en productivité dans ce domaine critique du développement de médicaments.

Références

1. BioPharm Guide to Formulation, Fill and Finish, 2001, supplement to BioPharm (Advanstar Communications).

2. McNally, E.J., ed., Protein Formulation and Delivery Marcel Dekker, Inc, New York 2000.

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