Valorisation de la recherche de médicaments pour des applications allant du développement des tests à l'optimisation des leads avec le MicroCal ITC de Malvern

Introduction

L'objectif de toute recherche pharmaceutique est de moduler l'activité d'une cible de sorte à susciter une réponse thérapeutique bénéfique. Un médicament n'est normalement actif que lorsqu'il est lié à sa ou ses cibles physiologiques et qu'il en module l'activité. Par conséquent l'essentiel des phases précoces de la recherche de médicaments est focalisé sur l'optimisation de l'affinité et de la sélectivité envers sa cible, d'un médicament candidat.

La titration calorimétrique isotherme (ITC) est largement utilisée pour la mesure des paramètres thermodynamiques de liaison pour les interactions entre des petites molécules et des protéines. La mesure simultanée de l'affinité de liaison (K_D), de la stœchiométrie (n), de l'énergie libre (ΔG), de l'enthalpie (ΔH) et de l'entropie (ΔS) fournit des informations importantes pour différentes étapes du processus de développement d'un médicament.

Les exemples suivants illustrent comment les informations détaillées sur l'interaction, fournies par le système MicroCal iTC200, contribuent aux différentes étapes de la recherche d'un médicament.

Une étude implique l'évaluation d'un peptide se liant à une protéine cible durant le développement d'une méthode de dosage. L'objectif ici est d'améliorer la compréhension des mécanismes d'interaction d'une protéine cible et d'une future, potentielle, substance médicamenteuse. De plus, les données qui en résultent, en particulier la stœchiométrie (n) et l'affinité (K_D), peuvent être utilisées pour évaluer la qualité et l'activité de préparations de protéines cibles subséquentes.

Une deuxième application utilise l'ITC comme une méthode complémentaire pour étudier les hits se liant à une protéine cible, après un criblage primaire. Un résultat positif obtenu par ITC, combiné à des données de dosage biochimique et à des données provenant d'autres techniques biophysiques (comme la résonance plasmonique de surface (SPR) et la résonance magnétique nucléaire (RMN)), permet de distinguer avec précision les véritables hits des faux positifs.

La dernière étude s'intéresse aux contributions enthalpique et entropique de l'énergie libre pour des composés en phase d'optimisation des leads. La mesure simultanée de l'affinité de liaison (K_D), de la stœchiométrie (n), de l'énergie libre (ΔG), de l'enthalpie (ΔH) et de l'entropie (ΔS) fournit des informations importantes qui soutiennent le développement de leads. Les contributions enthalpique et de entropique à l'énergie de liaison fournissent des indices sur la façon dont le médicament potentiel interagit avec la cible. Ces informations peuvent être utilisées pour comprendre des relations structure-activité et pour soutenir la conception de médicament assistée par ordinateur.

Bien que l'ITC fournisse ces informations importantes et détaillées en une unique expérience, cette technologie n'a pas toujours été très utilisée pour la recherche de médicaments, à cause de la consommation non négligeable de protéine et de composés associée aux méthodologies classiques. L'arrivée du MicroCal iTC200 résout ce problème. En comparaison des anciens systèmes ITC, celui-ci permet de réduire la consommation d'échantillon d'un facteur sept et atteint l'équilibre deux à quatre fois plus vite, ce qui se traduit directement par une augmentation de la productivité.

Matériels et méthodes

Tous les peptides, toutes les protéines et les petites molécules ont été produits en interne chez Hoffmann La-Roche. L'instrument MicroCal iTC200 est disponible auprès de Malvern Instruments. Toutes les expériences ont été réalisées à 25 °C.

Tous les tampons ont été dégazés avant utilisation. La cellule d'échantillon a été remplie de Bcl-2 (solution 30 µM) dans 50 mM de HEPES, pH 7,4, 100 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP, et 5 % de DMSO. Les peptides ont été dilués à une concentration de 250 µM dans le même tampon. Chaque volume d'injection était de 3 µl, le temps d'injection de 6 s, avec un délai de 150 s entre les injections. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel Origin™ adapté pour MicroCal (OriginLabs).

Fig 1. Données brutes et isothermes de liaison pour l'interaction des peptides avec 30 µM de la protéine cible Bcl-2. (A) Injection de 250 µM de peptide de type BAD. (B) Injection de 300 µM de peptide de type BAX.

Comparaison des mécanismes d'interaction lors du développement d'un test

Des données d'ITC, en particulier la stœchiométrie (n) et la constante d'affinité (K_D), ont été utilisées pour évaluer la qualité des préparations de protéine.

Dans cet exemple, l'interaction de deux peptides différents avec la protéine cible Bcl-2 (nom dérivé de B cell lymphoma 2 - lymphome B 2) a été étudiée à l'aide du MicroCal iTC200. Les résultats sont présentés sur la figure 1. L'affinité de liaison du peptide de type BAD (Bcl-2-associated death promoter - gène pro-apoptotique) pour la protéine Bcl-2 est environ six fois plus forte que celle du peptide BAX (protéine Bcl-2-associated X).

La visualisation des paramètres thermodynamiques sous la forme d'un tracé caractéristique de la liaison (fig 2) facilite la lecture des contributions des composantes enthalpique et entropique à l'affinité globale, représentée ici par ΔG. Ces tracés révèlent que la liaison du peptide de type BAD avec Bcl-2 est constituée d'interactions polaires et d'interactions hydrophobes, comme cela est indiqué par l'enthalpie de liaison (ΔH) négative ou favorable et le facteur d'entropie (TΔS). La liaison du BAX implique plus de changements de conformation, comme cela est indiqué par l'entropie défavorable.

Fig 2. Signature de la liaison (énergie libre, enthalpie de liaison et facteur entropique) des deux événements de liaison

Évaluation de la qualité d'une protéine

L'ITC peut être utilisée pour évaluer le niveau d'activité de liaison de la protéine cible avant son utilisation dans une campagne de criblage. Dans cette étude, deux lots de protéine cible ont été comparés par titration avec un peptide témoin positif qui se lie à la protéine cible avec une affinité de 97 nM (fig 3).

Fig 3. Deux lots de protéine cible (respectivement A et B) titrés avec un peptide témoin positif. La cellule d'échantillon contenait la protéine à une concentration de 10 µM, et la solution de peptide était à 50 µM.

Le résultat pour le premier lot, Lot A (fig 3 A) montre une isotherme attendue avec une K_D de 97 nM et n = 1, ce qui indique une protéine totalement active. Le second lot, Lot B (fig 3 B) a une K_D de 135 nM mais n n'est que de 0,23, ce qui indique une protéine seulement partiellement active. L'analyse de ces données, mais avec une concentration en protéine de 2,3 µM à la place de 10 µM, donne la même valeur de K_D et n = 1. Ceci indique que 75 % des protéines du Lot B étaient inactives. La protéine du Lot B a été rejetée et n'a pas été
utilisée pour la campagne de criblage.

Utilisations de méthodes complémentaires pour la confirmation de hits

Il est important d'exclure au plus tôt les faux positifs d'une campagne de criblage. Une solution 20 µM de la protéine cible (TP) a été titrée avec un composé X (fig 4). La K_D (définie comme 1/K_A) a été déterminée comme étant de 4,9 µM, ce qui est en accord avec les études réalisées par SPR et RMN, et confirme donc que le composé X est un véritable hit et mérite d'être étudié plus avant.

Fig 4. Données brutes et isotherme de liaison pour l'interaction du composé X avec la TP ; les données montrent une liaison réversible

Quand la même protéine cible a été titrée avec un composé Y les résultats ont été très différents (fig 5). Sur le panneau de gauche, le composé Y a été titré avec la TP. L'isotherme montre une affinité de liaison apparente de 120 nM mais l'enthalpie de liaison était environ 1000 fois plus grande qu'attendu et la stœchiométrie était très faible (n = 0,01). Sur le panneau de droite, le même médicament candidat a été titré avec du sérum-albumine bovin (BSA). Pris ensemble, les résultats indiquent une activité non spécifique. Sur la base de ces expériences, le composé Y a été considéré comme un faux positif et a été exclu de l'étude.

Fig 5. Données de titration du composé Y avec la TP (à gauche) et le BSA (à droite)

Optimisation des leads

Des études antérieures de la liaison du composé A à la TP ont suggéré une K_D de 25 nM. Une expérience d'ITC a été réalisée pour pousser plus loin la caractérisation des paramètres thermodynamiques de cette interaction (fig 6). Une solution à 100 µM du composé A a été titrée dans une solution à 10 µM de TP et la valeur de K_D était de 65 nM. La signature de la liaison (fig 7) montre que l'affinité est fortement due aux interactions enthalpiques mais défavorisée par l'entropie.

Les interactions enthalpiques sont généralement dues aux liaisons hydrogène et aux interactions de Van der Waals alors que l'affinité de liaison entropique favorable provient d'interactions hydrophobes. L'entropie défavorable, comme dans cet exemple, provient d'une diminution globale des degrés de liberté des espèces en interaction par rapport au complexe. Ceci est toujours le cas quand deux molécules interagissent mais l'amplitude de l'effet suggère que la protéine a subi un changement de conformation ou que le ligand est très flexible. Une réduction de cette entropie défavorable offre une voie d'optimisation qui peut être suivie par ITC.

Il a déjà été montré qu'il est plus difficile d'optimiser l'enthalpie que l'entropie de liaison, et que le fait de se reposer de façon trop importante sur l'optimisation de l'affinité sur la seule base de ces paramètres peut conduire à un composé ayant de piètres propriétés pharmacocinétiques (trop hydrophile ou trop hydrophobe). Ceci suggère qu'il est préférable de démarrer avec un lead favorisé par l'enthalpie, puis de la modifier pour en améliorer les interactions entropiques.

Fig 6. Isotherme de liaison pour l'interaction du composé A avec la protéine cible

Fig 7. La signature de liaison du composé A avec la protéine cible montre une contribution significative des liaisons hydrogène dans l'interaction.

Conclusions

Grâce à l'utilisation du MicroCal iTC200, la technique ITC a été intégrée au processus de recherche d'un médicament, et il a été montré que :

• Les valeurs de stœchiométrie (n) obtenues à partir des expériences d'ITC ont facilité l'évaluation de la qualité d'une protéine préalablement à des campagnes de criblage.
• L'ITC peut être utilisée pour filtrer des hits à l'étape de confirmation. Avec les informations obtenues par d'autres techniques de dosage de liaison, comme la SPR et le thermal shift, les hits confirmés peuvent intégrer un programme de développement de médicament.
• Des profils thermodynamiques complets fournissent des informations sur la façon dont des petites molécules interagissent avec la protéine cible, ce qui facilite le travail de chimie médicinale lors de l'amélioration des leads.
• L'ITC a été utilisée avec succès pour étudier les interactions protéine-peptide lors de plusieurs projets avec plusieurs peptides. Les informations d'enthalpie et d'entropie relatives à l'énergie de liaison contribuent à la compréhension du médicament potentiel et des interactions avec la cible.
• Des profils thermodynamiques complets sont obtenus en une unique expérience.
• La consommation de protéine ne constitue plus une contrainte importante. De manière générale, le MicroCal iTC200 utilise ~80 µg d'une protéine de 20 kD pour chaque expérience.

Remerciements

Les données ont été aimablement fournies par le Dr. Lin Gao, Hoffman-La Roche, Nutley NJ, USA.