Utilisation de la DSC pour étudier la stabilité de la région Fab d'un anticorps dans le but d'améliorer le développement d'une substance biothérapeutique

Introduction

La stabilité est un problème crucial pour le développement d'anticorps thérapeutiques et de fragments d'anticorps modifiés génétiquement. Une mauvaise stabilité peut affecter les niveaux d'expression d'un anticorps dans différents types de cellule, conduire à des populations fractionnées de substances non fonctionnelles ou mal repliées, ou, avec le temps, à la formation de grands agrégats de protéine potentiellement immunogènes.

Les anticorps et les protéines de type anticorps représentent un grand nombre, toujours croissant, d'entités moléculaires impliquées dans des essais cliniques sur l'homme pour quasiment toutes les indications pathologiques. Les anticorps sont des hétérotétramères constitués de chaînes lourdes et légères. Les domaines constants (chaînes C_H et C_L) contiennent des séquences d'acides aminés invariables qui dépendent de l'isotype et de la sous-classe de l'anticorps. Par opposition, les domaines variables de l'anticorps sont extraordinairement variés, et permettent la reconnaissance de quasiment n'importe quel antigène étranger avec une spécificité et une affinité élevées. La diversité des domaines variables dérive de l'appariement de chaînes lourdes variables (V_H) et de chaînes légères variables (V_L, kappa ou lambda), des nombreuses séquences de liaison entre domaines variables et constants, et de mutation hypersomatiques. La diversité au sein des domaines variables peut également conduire à des variations de stabilité entre différents anticorps.

Jusqu'à récemment, les données relatives à la stabilité d'anticorps complets faisaient défaut, probablement du fait qu'il s'agit de protéines multi-domaines complexes. Dans ce document, nous étudions les propriétés de dénaturation en fonction du domaine de 17 anticorps IgG₁ et IgG₄ humains ou humanisés, à l'aide de la calorimétrie différentielle à balayage (DSC) (1). Ces anticorps sont le Tysabri™ (cliniquement approuvé pour le traitement de la sclérose en plaques), sept molécules en essais de phase I ou II, quatre molécules en voie de classement comme nouveau médicament de recherche (NMR) par la FDA en 2007, et six molécules au stade recherche. Ces données peuvent être utilisées comme guide de référence pour aider les chercheurs travaillant sur les anticorps, à comprendre si la stabilité thermique peut ou non être un problème pour un anticorps donnée.

La seconde partie de cette note d'application décrit un processus permettant de redonner de la stabilité, par ingénierie, à un anticorps particulièrement instable. Une combinaison de mutations de stabilisation ayant conduit à un Fab dont le point médian de dénaturation thermique (T_m) est de 92 °C, mesuré par DSC. La stabilisation a conduit à une expression fonctionnelle très supérieure du fragment d'anticorps dans E. coli (2).

Matériels et méthodes

Les matériels et méthodes utilisés pour cette étude ont déjà été décrits (1, 2). Les travaux de DSC ont été réalisés sur un système MicroCal VP-Capillary DSC de Malvern.

Fig 1. (A) Courbe DSC du BIIB7 IgG₁. Les structures d'un anticorps IgG₁ humain complet sont représentées sur les courbes (13). (B) Courbes DSC représentant les quatre sous-classes d'IgG humain. Reproduit à partir de (1) avec la permission d'Elsevier.

Fig 2. (A) Courbes de dénaturation thermique DSC de quatre anticorps IgG₁ humains ou humanisés, BIIB16, BIIB6, BIIB4 et BIIB1. (B) Courbes de dénaturation DSC de l'anticorps BIIB7 aux formats IgG₁ et IgG₄. Reproduit à partir de (1) avec la permission d'Elsevier.

Mesures de stabilité du Fab de 18 séquences IgG humaines ou humanisées

Puisque leurs domaines constants sont pour ainsi dire identiques, les IgG de sous-classes similaires ne varient en stabilité que sur la base des différences de leurs régions Fv. Pour étudier les plages de stabilité des Fab des IgG des anticorps humains ou humanisés, en particulier des IgG₁, des études par DSC ont été réalisées sur un panel de 18 anticorps humains ou humanisés complets, notés BIIB1–18. Les transitions Fab ont généralement des valeurs de CP_max (c.-à-d., la hauteur du pic d'une courbe DSC) approximativement trois fois supérieures à celle des domaines C_H2 ou C_H3, comme le montre le tracé DSC du BIIB7 (fig 1A). Les tracés DSC caractéristiques des quatre sous-classes d'IgG humaines sont représentés sur la figure 1B, l'IgG₁ montrant la stabilité Fc apparente de l'anticorps la plus élevée. L'agrégation durant le processus de dénaturation affecte la T_m du Fab mesurée par DSC (3, 4) ; par conséquent, le balayage de DSC a été réalisé dans des conditions identiques pour chacun des anticorps, et les informations obtenues ont été considérées comme une mesure relative de la stabilité de chacun des domaines.

Du fait des différences au niveau des régions Fv, les transitions du Fab des BIIB1 à 18 varient significativement au niveau de la stabilité thermique relative. Les courbes de DSC représentées sur la figure 2A illustrent comment chaque région Fv individuelle peut conduire à des comportements différents au niveau de la dénaturation du Fab. La plage des valeurs de T_m de Fab des 18 anticorps BIIB allait de 57,2 °C à 81,6 °C (tableau 1). Les trois anticorps ayant les valeurs de T_m de Fab les plus basses, BIIB15 à 17, montrent plusieurs transitions de dénaturation pour leurs Fab, suggérant une rupture de la coopération de la dénaturation (voir la fig. 2A pour la courbe de DSC du BIIB16). Le pic de Fab de ces anticorps a été divisé en deux transitions. Les transitions ayant la Tm la plus basse sont répertoriées dans le tableau 1. Une seconde transition, pouvant représenter la dénaturation du C_H1/C_L, a lieu à des valeurs de T_m de 74 °C, 72 °C et 70 °C, respectivement pour les BIIB15, BIIB16 et BIIB17.

Bien que les études de DSC aient été réalisées avec des protéines hétérotétramères idéales selon une détermination par chromatographie d'exclusion stérique, l'anticorps dont le Fab était le moins stable, BIIB17, a mal été produit et s'est accumulé sous forme d'agrégats de haut poids moléculaire lorsqu'il était maintenu en solution entre 2 °C et 8 °C pendant 1 semaine. Les transitions de dénaturation des domaines C_H2 et C_H3 de chacune des IgG₁ se superposent bien (des tracés représentatifs sont portés sur la fig 2A). Il en est de même pour les transitions de domaines C_H2 et C_H3 des trois IgG₄ (données non représentées).

Le BIIB7 a été conçu à la fois comme une IgG₁ et une IgG₄. Les séquences de C_H1 des IgG₁ et IgG₄ diffèrent par dix acides aminés (six sont conservés) et par le motif du pont disulfure avec le domaine C_L. Les valeurs apparentes de T_m de Fab du BIIB7 des formats IgG₁ et IgG₄ étaient similaires (ΔT_m < 1 °C, fig 2B) après déconvolution des pics. Cette similitude suggère que les thermostabilités des Fab entre l'IgG₁ et l'IgG₄ peuvent être comparées directement.

Amélioration de la stabilité par modification génétique des résidus Fab

Il est bien établi qu'il est possible de stabiliser des protéines grâce à une conception consensus – la mutation des acides aminés rares pour les acides aminés consensus trouvés dans les séquences de protéines homologues. Ceci est soutenu par le fait que les anticorps BIIB humanisés les moins stables selon la DSC, semblent avoir les niveaux les plus élevés d'acides aminés rares dans leur structure. Dans le but de développer des anticorps et des stratégies de stabilisation de fragments d'anticorps, nous avons sélectionné un Fab au comportement médiocre, et effectué des modifications par mutagénèse pour redonner de la stabilité au Fab. Nous avons commencé par un Fab reconnaissant l'anatoxine tétanique (αTT) et dérivant d'une source humaine (5). Nous avons choisi 45 positions de résidus afin de réaliser une randomisation. Le détail complet de cette campagne de mutagénèse saturante est décrit dans la référence (2).

Fig 3. Analyse DSC du Fab αTT de type sauvage et des 12 Fab contenant différentes combinaisons mutantes dont le V11, le Fab le plus stable. L'identité de chaque courbe peut être obtenue à partir des valeurs de ΔT_m répertoriées dans le tableau 2. Reproduit à partir de (2) avec la permission d'Oxford University Press.

Mutagénèse et criblage de thermotolérance d'une bibliothèque de Fab αTT

Les réactions PCR des 45 mutants ont chacune été transformées, et près de 4500 colonies ont été prélevées et cultivées dans des plaques à 96 puits contenant le milieu d'expression. Les surnageants contenant le Fab ont été soumis à un chauffage à trois températures différentes ; 70 °C, 72 °C, et 74 °C (2). Les variants dont la thermostabilité apparaissait améliorée ont été ré-exposés afin de dupliquer l'analyse de thermotolérance et de confirmer leurs propriétés.

Une liste complète des mutations stabilisatrices est donnée dans la référence (2). La thermostabilité a été améliorée pour environ 1 % des variants de la bibliothèque. Quatorze des « hits » concernaient le domaine V_H, les quatre autres concernaient le domaine V_L. Ce résultat suggère que la stabilité du Fab natif était limitée par la stabilité marginale du V_H. De façon surprenante, aucun mutant de la bibliothèque de domaines constants d'environ 2000 membres ne s'est avéré stabiliser le Fab dans son ensemble. Nous supposons que des mutations stabilisatrices ont effectivement lieu dans les domaines constants, mais que la stabilité limitée du domaine V_H contrôle la température à laquelle se déplie le Fab et nous empêche d'observer ces événements ; voir les expériences de DSC ci-dessous.

Une autre explication à l'incapacité de découvrir les mutations stabilisatrices dans les régions C_L/C_H1 peut être qu'une période de dénaturation de 10 minutes à des températures élevées étaient insuffisante pour une dénaturation totale des domaines constants. Röthlisberger et ses collaborateurs ont montré que la dénaturation des hétérodimères C_L/C_H1 est extrêmement lente (6) et que la stabilité des quatre domaines Fab profite de cette stabilisation cinétique. Il est par conséquent possible que les domaines constants ne puissent pas se déplier dans le temps relativement court de l'exposition thermique.

Bien que nombre des mutations stabilisatrices de V_H ne correspondent pas au consensus global, la majorité des mutations correspond bien au consensus pour au moins un ou plusieurs des autres sous-classes de lignée germinale V_H (2). Par exemple, la position 72 du V_H d'αTT a été optimisée par mutation d'une Asn. Son résidu consensus dans toutes les sous-familles de lignée germinale V_H est l'acide aminé isostérique Asp. Après séquençage de la plaque bibliothèque sur 72 résidus, il a par hasard été trouvé que l'Asp n'était pas représenté. De plus, même si V89 est le consensus très majoritaire dans la plupart des sous-familles V_H humaines, une mutation en Val n'a pas amélioré la stabilité du Fab. Le résidu consensus V_H2 isostérique Thr a montré un fort caractère stabilisateur lors du criblage (ΔT_m > 2 °C). De même, l'Ile ramifiée en bêta était l'une des mutations apportant le plus de stabilité, trouvée lors du criblage, et elle ne se trouve qu'occasionnellement à cette position dans les séquences V_H humaines, mais elle n'est pas le résidu consensus des sous-classes V_H.

Quatre mutants stabilisateurs ont été découverts au sein du domaine V_L d'αTT. La mutation du résidu consensus V_K4 W50 en Ala (le résidu consensus pour V_K1) ou His était fortement stabilisatrice. L'histidine se trouve rarement en position 50 dans les domaines variables kappa humains, mais se trouve souvent dans les domaines variables lambda humains. Ce résidu est proche de l'interface entre les domaines V_H/V_L. Nous avons fait l'hypothèse que sa contribution à la stabilité du Fab pourrait être liée au renfort potentiel du domaine V_H puisque ce domaine V_H en particulier semble limiter la stabilité du Fab de l'αTT (2). Toutefois, des études sur le domaine V_L isolé suggèrent qu'il en va différemment (données non représentées). Une mutation du Tyr en His à cette position a été signalée comme améliorant la stabilité apparente et l'expression d'un scFv sans disulfure (7). Ainsi, il semble que dans plusieurs cas, la présence de groupes aromatiques de grande dimension au niveau du résidu 50, le résidu en position terminal C la plus extrême de la structure V_L 2,
n'était pas favorable à la stabilité du Fv.

Résultats de la combinaison de mutations stabilisatrices avec le Fab de l'αTT

Douze hybrides ont été générés, contenant entre trois et onze mutations stabilisatrices identifiées lors du criblage initial (tableau 2). Différentes combinaisons ont été dérivées de façon rationnelle pour déterminer la contribution apparente apportée par chaque mutant à la stabilisation du Fab.

De façon intéressante, l'introduction de plusieurs mutations stabilisatrices dans le Fab de l'αTT a augmenté l'expression du Fab dans une expérience de transformation/expression parallèle. Les meilleurs hybrides présentaient systématiquement des augmentations au moins trois fois supérieure à l'expression obtenue avec le type sauvage (tableau 2). La stabilité de chaque Fab a été évaluée par DSC (fig 3) et dichroïsme circulaire (CD) (données non représentées). Les scans par DSC et CD étaient systématiquement irréversibles et les solutions étaient très troubles après chauffage. Du fait de l'agrégation des Fab, les valeurs de T_m mesurées ont été utilisées pour classer la stabilité apparente des Fab.

La dénaturation couplée des quatre domaines est une caractéristique courante, bien que non systématique, des Fab, sous réserve qu'ils soient totalement liés par des ponts disulfure à la fois au niveau intra- et inter-moléculaire (1, 3, 6, 8, 9). Le découplage des réactions de dénaturation des protéines multidomaines, sur la base de différences sensibles entre les stabilités intrinsèques de chaque domaine, n'est pas courant et dépend de l'affinité globale des domaines entre eux et de la surface d'interaction totale entre les domaines (10, 11). En l'absence de portions du Fab, la dénaturation des autres domaines peut ne pas être couplée. Rowe et Tanford ont démontré que le V_L et le C_L d'une chaîne légère kappa semblent se dénaturer de façon non couplée lorsqu'ils ne sont pas liés à une chaîne lourde et au lieu de cela se déplient comme des domaines
isolés (12). Il semble que des contacts supplémentaires avec une chaîne lourde soient nécessaires pour qu'il y ait coopération. Röthlisberger et al. ont récemment publié des expériences complètes et élégantes montrant comment des domaines variables de stabilité différente peuvent se déplier indépendamment les uns des autres alors que des domaines variables domaines de stabilité élevée et similaire peuvent synchroniser les transitions de dénaturation des quatre domaines du Fab (6). L'hybride Fab le plus stable décrit ici (T_m = 92 °C) semble également être à la limite du découplage des réactions de dénaturation thermique de ses domaines variables.

Les températures de fusion des douze variants de Fab ont été utilisées pour déconvoluer le contribution individuelle à la stabilité de chaque mutation. Toutes les mutations semblent contribuer de façon additive à la stabilité du Fab, même si plusieurs de ces résidus sont relativement proches les uns des autres dans la séquence primaire et dans le repliement tertiaire du Fab. L'analyse a indiqué que quatre mutations représentent ~86 % de la stabilisation du Fab. Les mutations G24A, T72N et F89I du domaine V_H augmentent chacune la T_m de l'hybride Fab de respectivement 3,0 °C, 2,8 °C et 2,8 °C. La mutation W50H du domaine V_L a augmenté la thermostabilité du Fab de 3,5 °C.

La stabilité thermique du Fab est en accord avec la fraction de la protéine fonctionnelle exprimée par E. coli

Une considération importante suite à la mutagénèse de la structure était l'effet potentiel que celle-ci peut avoir sur la fonction de liaison de l'antigène du Fab d'αTT. Les mutations thermostabilisatrices ont été dérivées du criblage initial par ELISA quantitative détectant à la fois le domaine C_L et le marqueur histidine au niveau de l'extrémité C du C_H1. Il a souvent été supposé que la dynamique d'un domaine Fv pourrait avoir un effet marqué sur la liaison avec l'antigène. Nous nous sommes demandé si les mutations stabilisatrices introduites dans les régions de la structure Fv pourraient perturber un équilibre dynamique important pour l'ancrage de l'antigène.

Les mutations thermostabilisatrices n'ont pas atténué la fonction de la molécule exprimée par E. coli, mais ont en fait augmenté l'affinité apparente du Fab d'αTT dans un dosage ELISA fonctionnel (tableau 2). Les dosages ELISA fonctionnels avec l'antigène de deux préparations de Fab de type sauvage n'ont pas donné le même titre, ce qui indique que des petites variations durant la culture cellulaire peuvent contrôler subtilement le degré d'expression du Fab fonctionnel. Les deux préparations de type sauvage ont donné moins de protéine fonctionnelle que la plupart des hybrides Fab d'αTT stabilisés. La capacité fonctionnelle de chaque variant Fab semble être directement corrélée à sa stabilité, telle qu'elle est décrite par la T_m (fig 4). Lorsque les mutations étaient distantes des boucles de liaison prédites, il est peu probable que ces résidus aient directement augmenté le contact avec l'antigène.

Sur la base du comportement du Fab d'αTT du type sauvage, nous pensons qu'une fraction des Fab secrétés par E. coli se trouve sous une forme non fonctionnelle ou mal repliée. Cette interprétation corrèle bien avec le fait que le domaine V_L isolé, quand il est secrété par E. coli, se trouvait dans une conformation très différente de celle du V_L exprimé dans l'environnement oxydant du cytosol du BL21trxB(DE3) (résultats non représentés). Ceci explique également la variation fonctionnelle observée entre les lots de Fab produits.

Fig 4. Tracé comparant les T_m de chaque Fab en fonction de la concentration au point médian de chaque courbe sigmoïde de liaison du dosage ELISA fonctionnel des Fab. Reproduit à partir de (2) avec la permission d'Oxford University Press.

Résumé

Les profils de dénaturation thermique de 18 anticorps humains ou humanisés ont été mesurés par DSC et une plage de stabilité étendue des Fab a été identifiée. En utilisant une conception consensus, nous avons réalisé une mutagénèse par saturation d'un Fab particulièrement instable pour en modifier la stabilité. Un criblage des bibliothèques de Fab par test sous exposition thermique a conduit à l'identification de 19 mutations stabilisatrices sur 11 sites du Fab. Une combinaison des mutations stabilisatrices a conduit à des augmentations de la stabilité thermique (jusqu'à 92 °C), une augmentation de l'expression bactérienne, et une diminution significative des produits mal repliés et non fonctionnels. La DSC a permis de déterminer rapidement les facteurs contribuant à la stabilité des anticorps, et s'est avérée être une bonne technique d'indication de la stabilité, qui peut être appliquée à tout développement de substances biothérapeutiques.

Remerciements

Cette note d'application est signée de Stephen J Demarest, Ellen Garber, Gang Chen, Bruce E. Kimmel, David Gustafson, Jane Wu, Jared Salbato, John Poland, Marikka Elia, Xuqiu Tan, Ken Wong, Jay M. Short, et Geneviève Hansen de Biogen Idec, San Diego, CA US.

Références

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2. Demarest , S. J. et al. Engineering stability into Escherichia coli secreted Fabs leads to increased functional expression. Protein Engng. Des. Select. 19, 325-336 (2006).
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