La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est un outil puissant de mesure de la stabilité, qui permet d'étudier la dénaturation des protéines sans avoir à recourir à un marquage ou à des sondes artificielles. Elle détermine la chaleur absorbée par un échantillon lorsque la protéine se déplie, ce qui donne une mesure de sa stabilité thermique. Dans cette note d'application, les données de stabilité thermique obtenues par DSC sont utilisées pour prédire la stabilité lors du stockage à long terme.
Durant sa vie, une protéine thérapeutique sera soumise à différentes conditions, que ce soit lors de sa manipulation ou son stockage. Celles-ci impliquent souvent un pH bas, différents composants tampons et des forces ioniques variables, ainsi que des fluctuations de température durant le stockage et le transport. De plus, la formulation finale doit être stable pendant plusieurs années, et ce alors que les concentrations de protéine sont souvent élevées. Le médicament final administré au patient doit préserver sa conformation native et son activité, avec un degré minimal d'auto-association et d'agrégation. Tout outil analytique capable d'étudier l'effet de ces conditions sur la conformation et l'auto-association de la protéine, facilitera la sélection des candidats biothérapeutiques dont le développement doit être poussé plus avant, ainsi que la sélection des conditions à utiliser pour le procédé et la formulation.
La DSC est couramment utilisée pour évaluer la stabilité thermique et conformationnelle d'une protéine dans différentes conditions tampon (1-6). La température de dénaturation d'une protéine, ou de domaines individuels, peut être déduite du profil DSC (6). Si la réaction est réversible, il est également possible de déterminer les paramètres thermodynamiques de la dénaturation. De plus, la dénaturation s'accompagne souvent d'une courbe exothermique, qui correspond à l'agrégation et à la précipitation de la protéine dénaturée.
La DSC a été utilisée pour caractériser la dénaturation des anticorps et des fragments Fc induite par la chaleur, avec identification des transitions de chacun des domaines (6-9). Le domaine CH2 se déplie généralement en premier (7), suivi des domaines Fab puis CH3.
Plusieurs expériences contrôlées (figure 1) indiquent que les domaines CH2 et CH3 du fragment Fc se déplient respectivement à 71,0 et 83,1 °C, dans des conditions proches des conditions physiologiques (PBS). La transition thermique du domaine Fab d'un anticorps monoclonal (MAb) a généralement lieu entre les transitions des domaines CH2 et CH3 ou chevauche l'une de ces deux transitions.
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La SEC ou filtration sur gel (GF) est couramment utilisée comme test indicatif de la stabilité, ce qui permet une quantification du monomère et des autres espèces de haut poids moléculaire générées par les conditions auxquelles est exposée la protéine, ou durant le stockage.
Dans les travaux exposés ici, nous comparons la stabilité de différents anticorps et protéines couplées à un Fc stockés dans différentes conditions à différentes températures, déterminée par analyse SEC-HPLC, avec la stabilité prédite par DSC dans le même tampon. Les résultats démontrent qu'il est possible d'utiliser la DSC pour sélectionner les conditions dans lesquelles les protéines sont les plus stables pour un stockage à long terme, et également pour étudier différentes protéines apparentées, comme des analogues, pour en déduire leur stabilité relative à long terme.
Sauf indication contraire, les échantillons ont été préparés dans du citrate de sodium à 20 mM avec 140 mM de NaCl, au pH indiqué. Deux jeux d'échantillons identiques de chaque protéine ont été préparés : un jeu pour l'analyse DSC et l'autre pour l'analyse HPLC. Toutes les expériences ont été conduites avec une concentration en protéine de 0,5 mg/ml.
La température de stockage par défaut était de 4 °C pour tous les échantillons. Toutefois, pour la plupart des protéines utilisées dans cette étude, des mois, voire des années, peuvent être nécessaires pour observer des changements d'agrégation à cette température, ce qui reflète la longue durée de conservation désirée pour une protéine thérapeutique satisfaisante. Une température de stockage de 37 °C a donc également été utilisée afin de pouvoir conduire ce projet dans un temps limité (deux mois).
Un système SEC-HPLC du commerce a été utilisé pour l'étude. Il était pourvu des détecteurs en ligne suivants : UV, diffusion de la lumière et indice de réfraction (SEC-UV/LS/RI). La colonne SEC Tosoh TSKgel™ G3000SWXL (7,8 × 300 mm) SEC avait un débit de 0,5 ml/min et les échantillons étaient injectés aux temps indiqués. Les chromatogrammes UV ont été enregistrés à 280 nm.
Les expériences de DSC ont été réalisées sur un système MicroCal VP-DSC de Malvern. Tous les échantillons ont été dégazés pendant cinq minutes avant l'analyse. La cellule de référence était remplie du tampon correspondant au tampon de l'échantillon. Les échantillons ont été chauffés de 4 à 110 °C à un taux de 60 °C/h. La pré-analyse était de 15 minutes, la période de filtration était de 10 s, et le mode de retour/gain était défini sur passif. Le point de demi-transition thermique (Tm) a été obtenu par analyse des données avec le logiciel Origin™ 7.
Les courbes DSC d'une protéine X couplée à un Fc à différentes valeurs de pH sont présentées sur la figure 2. Les températures de transition thermique des analyses sont également indiquées. À pH 7, deux transitions thermiques sont relevées, à 65,4 °C et 78,9 °C, qui correspondent à la dénaturation des domaines CH2 et CH3. La température de transition thermique décroit quand le pH diminue, et l'ordre de stabilité prédit par DSC est pH 7 > pH 5 > pH 4. La stabilité réelle de la protéine a été étudiée par SEC-HPLC avec détecteurs UV, à diffusion de la lumière et à indice de réfraction, en ligne. L'avantage de l'utilisation du détecteur à diffusion de la lumière est que le pic du monomère peut être facilement confirmé (10). Les chromatogrammes SEC de la protéine X couplée à un Fc stockée à 4 °C, à pH 7 et à pH 4, sont respectivement présentés sur les figures 3 et 4. La comparaison des pourcentages du pic du monomère à différents moments pour les échantillons à pH 7, pH 5 et pH 4 stockés à 4 °C est présentée sur la figure 5. Dans cette note d'application, toutes les valeurs de pourcentage des données SEC sur les monomères sont normalisées pour la valeur à T = 0.
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Comme il est très difficile de différencier la stabilité des échantillons à pH 7 et pH 5 en quelques semaines à 4 °C, des études accélérées ont été réalisées à 37 °C. La comparaison des pourcentages du pic du monomère obtenu par SEC à différents temps pour les échantillons à pH 7 et pH 5 est présentée sur la figure 6. Pour un stockage à 37 °C, les stabilités de la protéine X couplée à un Fc à pH 7 et pH 5 sont clairement différenciées. L'augmentation du pourcentage du pic du monomère au-delà de 100 % pour les échantillons stockés à 37 °C est due à l'évaporation. Celle-ci a été constatée pour tous les échantillons conservés à 37 °C, et a conduit à une augmentation de la concentration en protéine dans tous les échantillons.
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Les résultats de SEC tirés des deux séries d'expériences ci-dessus (à 4 et 37 °C) suggèrent clairement que la stabilité réelle de la protéine X couplée à un Fc est comme suit pH 7 > pH 5 > pH 4, ce qui confirme la prédiction faite par DSC.
Les courbes de DSC pour la protéine X couplée à un Fc à pH 6 et pH 5 sont présentées sur la figure 7. La comparaison du pourcentage du pic du monomère à différents moments après stockage à 37 °C, obtenu par SEC pour les échantillons à pH 6 et pH 5, sont présentés sur la figure 8. Encore une fois, les résultats suggèrent que l'ordre de stabilité prédit par DSC, pH 6 > pH 5, est en très bonne corrélation avec les données de stabilité réelle obtenues par SEC.
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Un autre facteur contribuant à la stabilité thermique apparente est la solubilité de la protéine dénaturée. Lorsqu'on utilise le MicroCal VP-DSC de Malvern, l'exotherme final (courbe fortement pentue orientée vers les valeurs négatives) après la transition reflète la solubilité de la protéine dénaturée. Ceci est un autre facteur, en plus de la température de transition, qui peut avoir un impact significatif sur la stabilité de la protéine.
L'agrégation/précipitation est une réaction irréversible. Lorsqu'elle a lieu, elle déplace l'équilibre réversible de la réaction de dénaturation en faveur de la forme dénaturée de la protéine. Ainsi, moins l'intermédiaire dénaturé est soluble, plus la dénaturation et l'agrégation augmenteront avec le temps. Si l'agrégation et la première transition thermique sont simultanées, alors l'agrégation a lieu avant la réaction totale. Ceci complique encore l'analyse.
Après avoir étudié la protéine X couplée à un Fc, la même méthode et la même procédure ont été utilisées pour un MAb. Les courbes DSC d'un MAb à différentes valeurs de pH sont présentées sur la figure 9. Les températures de transition thermique sont indiquées sur la figure. À pH 7, on observe une seule transition thermique, à 73,2 °C, suivie presque immédiatement de l'exotherme d'agrégation. Quand le pH est abaissé, la stabilité thermique du domaine CH2 diminue, et les valeurs de Tm sont de 66,1 °C et 47,9 °C, respectivement pour les échantillons à pH 5 et pH 4. L'ordre de stabilité prédit par DSC est pH 7 > pH 5 > pH 4.
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La stabilité réelle de la protéine a de nouveau été étudiée par SEC-HPLC. Le pic du monomère a été confirmé à l'aide du détecteur à diffusion de la lumière (10). Les pourcentages du pic du monomère à différents moments pour les échantillons à pH 7 et pH 4 stockés à 4 °C ont été comparés (résultats non présentés). Comme il n'était pas faisable de conduire des expériences sur plusieurs mois pour différencier la stabilité du MAb Y à pH 7 par rapport à pH 4 pour un stockage à 4 °C, des études de dégradation accélérée ont été réalisées à 37 °C.
La comparaison des pourcentages du pic du monomère obtenus par SEC pour les échantillons à pH 7, pH 5 et pH 4 stockés à 37 °C est présentée sur la figure 10. Les résultats confirment l'ordre de stabilité prédit par DSC : pH 7 (légèrement) > pH 5 (significativement) > pH 4.
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Comme cela a été décrit plus haut, nous avons étudié la corrélation entre la stabilité thermique et la stabilité de la protéine à différentes valeurs de pH pour une même protéine. Nous avons également voulu voir s'il est possible d'utiliser cette même approche pour comparer la stabilité de protéines différentes dans des conditions tampons identiques. De manière générale, lors de la comparaison de différentes protéines, la corrélation entre la stabilité thermique et
la stabilité à long terme diminue lorsque les similitudes structurales entre les protéines diminuent. La DSC a été utilisée avec succès pour évaluer la stabilité de protéines apparentées, et en particulier le criblage d'analogues d'une même protéine.
Une comparaison des températures de transition thermique extraites des courbes DSC d'un MAb Y et d'une protéine X couplée à un Fc à pH 4, pH 5 et pH 7 est présentée sur la figure 11. Les comparaisons des pourcentages du pic du monomère du MAb Y et de la protéine X couplée à un Fc à pH 4, pH 5, et pH 7 sont présentées sur les figures 12 à 14. À pH 4 et pH 5, la prédiction de l'ordre de stabilité reposant sur la DSC (MAb Y > protéine X couplée à un Fc) est clairement confirmée par les données de stabilité obtenues par SEC. Les données à pH 7 sont plus complexes. Les données de stabilité obtenues par DSC montrent que le MAb est plus stable que la protéine X couplée à un Fc, mais la différence dans les données de SEC n'est pas claire.
Plusieurs facteurs peuvent expliquer cela. L'un est que les deux protéines sont très stables à pH 7 et qu'un temps de stockage beaucoup plus long est nécessaire pour observer par SEC des différences dans les quantités de monomère. Une autre raison possible est que la protéine X couplée à un Fc est plus stable que le MAb Y (figures 2 et 9) et que ceci compense en partie la différence entre les températures de transition thermique, et rend les stabilités réelles des deux protéines plus similaires que ce que l'on pourrait prédire à partir de la seule température de transition thermique. Ceci suggère que l'exotherme d'agrégation est également un facteur important à prendre en compte.
L'approche décrite dans cet article a également été utilisée pour étudier plusieurs protéines différentes : des anticorps et des couplées à un Fc. L'ordre relatif de stabilité thermique obtenu à partir des données de DSC reflète effectivement non seulement la stabilité au stockage réelle et l'agrégation d'une même protéine dans différents tampons telle qu'elles ont été constatées par analyse SEC-HPLC, mais également la stabilité au stockage réelle et l'agrégation de différentes protéines apparentées de manière plus générale.
Après avoir établi la corrélation entre la stabilité thermique et la stabilité au stockage d'une protéine donnée, la DSC peut être utilisée pour étudier différents mutants, différents hybrides, des protéines apparentées Fc, et des MAb. Comme cela a été montré plus haut, d'autres facteurs, tels que la solubilité des intermédiaires de la protéine dénaturée, et les similarités et les différences dans la structure de la protéine, doivent être pris en compte en plus de la température de transition thermique.
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La DSC a été utilisée pour étudier la stabilité thermique d'anticorps monoclonaux et de protéines couplées à un Fc à différents pH. La SEC-HPLC a été utilisée pour étudier la stabilité au stockage de ces mêmes protéines aux pH correspondants. Les données de stabilité obtenues par SEC-HPLC correspondent bien à la stabilité prédite par DSC, ce qui suggère que les données de stabilité thermique obtenues par DSC corrèlent avec la stabilité de la protéine à des températures plus basses. De plus, la stabilité thermique relative de protéines apparentées reflète également les différences de leur stabilité réelle à long terme. Par conséquent, la DSC est un outil utile pour prédire la stabilité d'une protéine aux basses températures, cribler des tampons et des excipients, cribler des candidats thérapeutiques et prédire l'agrégation des protéines.
Cette note d'application a été aimablement rédigée par Jie Wen, Yijia Jiang, Kathryn Hymes*, Ke Gong* et Linda Narhi, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA.
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