Généralement, la concentration en bactériophages ou particules virales est obtenue par Plaque Assay, ou dans le cas de cellules animales, par des tests de biologie cellulaire. Lors ces tests, les particules de virus infectieux sont cultivées dans des couches de cellules confluentes pour produire des plaques (zones de cellules détruites) qui peuvent être comptées pour déterminer le nombre d'unités formant la plaque (PFU, plaque forming units). Bien que cette technique offre un comptage direct et individuel des particules de virus infectieux, les particules de virus non infectieux, à l'inverse, ne produisent pas de plaques. De la même manière, les agrégats contenant plusieurs virus ne sont à l'origine que d'une seule plaque. Le fabricant a souvent besoin de connaître le nombre de particules de virus dans la préparation, qu'elles soient infectieuses ou non, ainsi que le degré auquel la préparation est sensible à l'agrégation (le cas échéant, indicateur précoce d'une durée de vie limitée).
La technique Nanoparticle Tracking Analysis (NTA, analyse de suivi des nanoparticules) permet de visualiser des particules à l'échelle nanométrique telles que les virus et agrégats de virus dans des liquides, en temps réel, directement et individuellement. Elle permet ainsi d'obtenir des profils de répartition des tailles de particules en haute résolution. La technique est rapide, fiable, précise et économique. Elle constitue un complément intéressant aux méthodes existantes d'analyse des nanoparticules, telles que le DLS (Dynamic Light Scattering, diffusion dynamique de la lumière), le PCS (Photon Correlation Spectroscopy, spectroscopie par corrélation de spectres) ou l'EM (Electron Microscopy, Microscopie Electronique).
La gamme NanoSight de Malvern Instruments fait appel à la technique NTA pour analyser les particules dans des liquides de 10 à 2 000 nm de diamètre. La technologie NTA combine les propriétés de diffusion de la lumière et du mouvement Brownien pour déterminer la distribution de tailles des particules dans une suspension liquide. Un faisceau laser traverse la chambre à échantillons. Les particules en suspension présentes sur le chemin de ce faisceau diffusent la lumière de telle sorte qu'elles sont facilement visualisées. L'équation de Stokes-Einstein permet ensuite de calculer la taille de chaque particule individuelle. Les résultats s'affichent sous la forme de graphiques de distribution de taille par rapport à une concentration en nombre (ou taille par rapport à la brillance relative).
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Les préparations de vaccins antiviraux doivent être garanties (validées) comme étant stables et comme contenant des proportions connues d'éléments actifs. La technique NTA offre une estimation immédiate et directe de la pureté et de la concentration des produits. De même, le degré et la vitesse de formation des agrégats dans une préparation de virus peuvent être mesurés grâce à la technique NTA, ce qui permet au fabricant de développer des processus de fabrication de produit améliorés et d'optimiser la durée de vie du produit.
La technique NTA permet de visualiser et de mesurer toutes les particules de la préparation. Elle offre donc des informations supplémentaires sur le contenu en nanoparticules plus rapidement que les tests conventionnels de Plaque Assays ou TCID50. Par exemple, la présence de particules plus grosses (qui sont à la fois mesurées et comptées par NTA) peut provenir de débris de cellules non virales issues de la culture cellulaire, ou des agrégats de particules virales contenant de nombreux virions individuels.
Dans les deux cas, ces agrégats/contaminants représentent un problème possible pour le fabricant, qui peut être immédiatement identifié grâce à un système NanoSight de Malvern.
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Les processus d'élimination de virus sont évalués en utilisant des échantillons viraux, préparés avec de hautes concentrations en virus (de différentes souches, en fonction de l'application). Ceux-ci sont ensuite utilisés pour tester les étapes du processus qui doivent être qualifiées en tant qu'étape d'élimination. Les mesures doivent être réalisées avec du matériel pur, hautement concentré, et qui doit d'abord être préparé et conservé avant utilisation. La technique NTA est idéale pour établir le statut d'agrégation avant et après le stockage.
La capacité de la gamme d'instruments Malvern NanoSight à établir rapidement le degré auquel une préparation de virus contient des contaminants ou des agrégats et à pouvoir quantifier leurs niveaux s'est révélé inestimable pour les développeurs de procédés, intéressés par l'optimisation des protocoles de purification dans la préparation de virus. Par exemple, la Figure 3 présente la différence entre une préparation de virus partiellement purifiée (ligne blanche) et le même échantillon ayant subi avec succès un protocole de purification efficace, qui a retiré tout matériel de contamination ou agrégé (ligne rouge). Notez que l'axe vertical représente la concentration de particules (particules de virus/mL).
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La détection et le comptage de particules de virus avec la technique NTA offre des informations essentielles aux chercheurs de l'Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences (IPBS) de l'Université de Strathclyde. Cette équipe développe des méthodes permettant d'utiliser les bactéries naturellement présentes pour combattre le MRSA (Meticillin-Resistant Staphylococcus Aureusis). Le MRSA est une variante de la bactérie "Staphylococcus aureus" ayant développé une résistance à la plupart des antibiotiques, ce qui la rend difficile à traiter et potentiellement mortelle. Bien que cette « superbactérie » puisse être tuée à l'aide de détergents, la dilution et l'application de ces derniers est souvent non constante et inefficace, faisant de la thérapie bactériophage une alternative intéressante. La thérapie phagique implique l'utilisation de bactériophages se répliquant à l'intérieur des bactéries provoquant ainsi la destruction de la cellule hôte par lyse cellulaire.
C'est ainsi pour la caractérisation de cultures de bactériophages que NTA est utilisée dans l'équipe du Dr. Mike Mattey, maître de conférences honoraire de l'IPBS. Les cultures de bactériophages doivent être caractérisées en amont de toute application. La concentration doit ainsi être évaluée avant d'appliquer les virus en couches sèches pour protéger les sites à haut risques d'invasion bactérienne : sutures, blessures, instruments, etc. La technique NTA permet à l'équipe de visualiser et de mesurer les cultures virales rapidement, en temps réel et à faible coût. « La caractérisation des populations de virus nécessite l'évaluation de l'agrégation dans la gamme comprise entre 20 et 1 000 nm », explique le Dr Mattey. "NanoSight offre une caractérisation d'échantillon de manière quantitative, simple et rapide. De plus, la technologie de NanoSight permet une visualisation de l'échantillon, appuyant ainsi les résultats du comptage de particules"
Une large gamme de types de virus a été analysée avec succès à ce jour, parmi lesquels les suivants :
(Carr, B. (2009) Nanoparticle tracking analysis: direct visualization for counting and characterizing virus particles in liquids, Meeting the challenge of viral pandemics, 2009 - biotech-online.com)
