Cette note d'application étudie la façon dont la gamme d'instruments NanoSight utilise la technique Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) pour déterminer l'état des nanoparticules, en particulier leur taille, leur répartition granulométrique et leur concentration dans les milieux d'essai avant des études nanotoxicologiques et écotoxicologiques.
La croissance rapide dans le développement et l'utilisation des nanoparticules (NP) artificielles continue d'anticiper la mise au point de méthodes d'évaluation et de gestion des risques qu'elles peuvent poser. Les nouvelles propriétés découlant de la taille des particules à l'échelle nanométrique sont la base des promesses de performance des nanomatériaux. Même lorsque la toxicologie associée au produit sous forme brute est bien comprise, la «lecture croisée» des propriétés pour les mêmes matériaux à l'échelle nanométrique ne peut pas s'effectuer automatiquemnt sur la base d’une hypothèse ; il s'agit essentiellement de nouveaux matériaux. On assiste à une prise de conscience du fait que les effets toxiques sur le long terme et l'impact potentiel de ces matériaux sur l'environnement sont mal compris. Par conséquent, les effets toxicologiques potentiels des nanomatériaux de synthèse suscitent un intérêt et des activités de recherche intenses, ainsi que l’évaluation de l'importance de la fraction des constituants à l’échelle nanométrique dans les produits et les formulations existants.
Avant de commencer toute étude nanotoxicologique, il est impératif de connaître l'état des nanoparticules utilisées, et en particulier leur taille, leur répartition granulométrique et leur concentration dans un milieu d'essai approprié.
La taille des particules détermine leur vitesse de diffusion, la pénétration ou l'exclusion par des barrières biologiques ainsi que les interactions entre particules.
Cette note présente l'application de la technique Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) dans la caractérisation des nanoparticules d'or et leurs agrégats dans un fluide biologiquement intéressant. Venant compléter les techniques de diffusion de la lumière classiques, la technique NTA permet de mesurer et de compter les nanoparticules en suspension particule par particule, offrant ainsi une compréhension plus fine de l'agrégation. L'étude observe le changement de taille des nanoparticules d'or, comparant le cas du dispersant standard (tampon au citrate) avec un plasma dilué contenant des protéines, NIST (2007).
Du sang a été prélevé sur des donneurs en bonne santé. Les tubes ont été centrifugés pendant 5 minutes à 800 RCF pour disperser les globules rouges et blancs. Le surnageant (plasma) a été transféré dans des tubes étiquetés, stockés à -80 ˚C. Après décongélation, le plasma a été centrifugé à nouveau pendant 3 min à 16,1 kRCF pour réduire davantage la présence de globules rouges et blancs. Les laborantins ont transféré le surnageant dans un nouveau récipient, en prenant soin de ne pas toucher la pastille.
Des nanoparticules d'or standard NIST d'un diamètre de 60 nm ont été utilisées (matériel de référence 8013du NIST). Elles ont été stockées, préparées et utilisées en accord avec les rapports d'enquête pertinents, NIST (2007). L'or a été dilué à une concentration d'environ 108 particules/ml à l'aide d'un tampon au citrate standard d'un pH de 7,19. Pour les dispersions dans le plasma, le plasma humain a été dilué à 1:106.d'un tampon citrate standard et 10 µl de nanoparticules d'or ont été dilués avec 790 µl de plasma dilué.
La technique Nanoparticle Tracking Analysis a été mise en oeuvre sur un NanoSight LM10. Toute la préparation et les mesures d'échantillon ont été menées à l’University College de Dublin, en Irlande. Plusieurs vidéos, durant chacune 166 s, ont été enregistrées et analysées à partir de mesures par lots afin d'assurer une invariance statistique. Le plasma étant un milieu ionique naturel, il est connu que l'agrégation des protéines fera toujours partie de la problématique.
Des vidéos des nanoparticules ont été enregistrées (Figure 1), suivies et analysées pour déterminer la taille et la concentration lorsqu'elles sont dilué dans un tampon citrate et dans le plasma humain, et corrigées de leur trajet réel (Figure 2).
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Les méthodes de mesure de l'or dilué dans un tampon de citrate étaient détaillées dans le rapport des matériaux de référence du NIST (2007).
La technique NTA peut être utilisée pour déterminer, visuellement et par une mesure de la concentration, que les particules sont toujours monodispersées, ce qui renforce l'hypothèse selon laquelle les protéines en suspension enrobent les nanoparticules (et selon laquelle l'augmentation de la taille n'est pas liée à l'agrégation).
Le changement de taille enregistré dans les Figures 1 et 2 présente une augmentation de la taille des nanoparticules d'environ 10 nm, correspondant à une couche de protéines adsorbées d'une épaisseur de 5 nm recouvrant la nanoparticule.
On constate donc une modification significative et mesurable de la répartition granulométrique de nanoparticules d'or monodisperses en suspension dans un milieu biologique tel que le plasma humain. Le Nanoparticle Tracking Analysis s’avère donc une technique adaptée à la mesure d’une fine épaisseur de protéines adsorbée à la surface de nanoparticules quand elles sont dispersées dans un plasma.
La taille moyenne et la largeur de la distribution de taille des particules d’or dispersées dans un tampon citrate et mesurées par la technique NTA sont semblables à celles déterminées par le NIST. En présence de plasma, la taille des particules et leur répartition granulométrique augmentent de façon similaire.
La technique NTA permet pour mesurer une concentration basée sur le nombre de nanoparticules d'or fournie par le NIST. La technique NTA est également idéale pour identifier et compter les agrégats de nanoparticules tels que les dimères, qui peuvent être différenciés rapidement. Elle représente ainsi (pour les nanoparticules et les régimes de concentration utilisés ici) un outil pratique dans la gamme existante de techniques disponibles pourl a nanobiologie et les interactions sur les nanomatériaux de synthèse en biologie.
La technique NTA est reconnue comme une méthode analytique fournissant des informations sur la taille des nanoparticules et de façon non moins importante, sur leur concentration. Elle permet également d'arriver à de tels résultats avec des types d'échantillons complexes et de grande polydispersité (Montes-Burgos et al., 2010; Lynch, 2008; Montes-Burgos et al., 2007). Les méthodes telles que le NTA peuvent être considérées comme l'un des moyens grâce auxquels l'impact environnemental et la toxicité cellulaire potentielle des nanoparticules pourront être étudiés à l'avenir (Borm et al., 2006; Tenuta, 2008; Tran and Anton, 2009; Kuhlbusch et al., 2010; Hassellöv and Kaegi, 2009; Stolpe et al., 2011).
De récentes études ont démontré l'infinie complexité des interactions entre les nanoparticules et les matrices environnementales, interactions qui représentent un défi important dans leur quantification et leur modélisation, mais la technique NTA peut offrir un mécanisme d'enquête et d'analyse (Gornati et al., 2009; Hartmann, 2011; Arvidsson et al., 2011; Howard, 2010; Njuguna et al., 2011; Tran et al., 2009).
Dans une étude des effets d'un enrobage appliqué à une nanoparticule de fer à valence nulle (nZVI) lors des premiers stades du cycle biologique de trois espèces invertébrées marines clés, Kadar et al. (2012) ont utilisé la technique NTA pour étudier la dissolution du nZVI dans l'eau de mer, démontrant que l'enrobage a permis de stabiliser la suspension des nanoparticules de métal. Kadar a également étudié par la technique NTA, l'effet de nanoparticules de fer artificielles pertinentes sur le plan industriel, sur la croissance et le métabolisme de cultures de microalgues marines. Il a décrit les altérations conséquentes de leur croissance, de leur répartition granulométrique, de leur profils de lipidiques et de leur structure cellulaire (Kadar et al., 2012)
En utilisant des puces à oligonucléotides 15k pour le Daphnia magna, un crustacé d'eau douce qui est une espèce indicatrice répandue pour l'évaluation de la toxicité, afin de différencier la toxicité spécifique des particules et des ions argent et de développer des biomarqueurs d'exposition pour les nanoparticules d'argent enrobées de citrate et enrobées de polyvinylpyrrolidone, Poynton et al. (2012) ont déterminé le degré d'agrégation des nanoparticules d'argent par la technique NTA avant d'étudier leur toxicité au niveau génomique.
En étudiant la toxicité des nanoparticules d'oxyde de zinc sur l'espèce Folsomia candida, Waalewijn-Kool et al. (2012) ont démontré que les différentes méthodes d'enrichissement de milieux d'exposition visant à tester les caractéristiques de répartition granulométrique, n'ont pas changé grand-chose à la capacité reproductrice de l'organisme, les techniques NTA et TEM indiquant toutes deux que la toxicité de l'oxyde de zinc n'était pas liée à la taille des particules.
Au niveau cellulaire, la technique NTA s'est avérée utile pour l'étude de la génotoxicité des nanoparticules de cobalt dans les leucocytes périphériques humains (Colognato et al., 2008) et les fibroblastes de souris (Ponti et al., 2009). Ce document montre la capacité des nanoparticules à traverser le placenta humain (Wick et al., 2009) et décrit les méthodes visant à étudier leurs effets sur d'autres barrières biologiques (Linn et al., 2010), notamment le transport des nanoparticules de silice dans la peau humaine (Staroňová et al., 2012). Similarly, Filon et al. (2012) ont rédigé un rapport sur la pénétration des nanoparticules de cobalt dans la peau humaine intacte et endommagée, suggérant que le cobalt appliqué en tant que nanoparticule peut pénétrer la peau humaine dans un système de diffusion in vitro.
La compréhension de la répartition granulométrique des nanoparticules avant leur introduction dans les systèmes cellulaires pour des tests cytotoxicologiques est cruciale. La technique NTA s'est révélée utile à cet égard (Kendall et al., 2009; Patel et al., 2010; Munaro, 2010; Karlsson, 2010). Les interactions chimiques de nanoparticules de types différents avec diverses matrices d'origine biologique telles que le sérum (Treuel et al., 2010), les polluants organiques (Ben-Moshe et al., 2009) et le dithiothréitol (Sauvain et al., 2008) ont également été étudiées.
Les effets toxicologiques des agrégats de nanoparticules de cobalt (Co-NP) ont été examinés et comparés à ceux des ions de cobalt grâce à différentes lignées cellulaires représentant le poumon, le foie, le rein, les intestins et le système immunitaire. Les conclusions générales correspondaient à l'hypothèse selon laquelle les effets toxiques des nanoparticules de cobalt agrégées sont principalement dus à la dissolution d'ions de cobalt des nanoparticules agrégées. (Limor et al., 2011).
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