Affinité de liaison

L'affinité de liaison désigne la force de l'interaction de liaison entre une biomolécule unique (telle qu'une protéine ou l'ADN) et son ligand/partenaire de liaison (tel qu'un médicament ou un inhibiteur). L'affinité de liaison est habituellement mesurée et signalée par la constante de dissociation à l'équilibre (K_D), qui permet d'évaluer et de hiérarchiser la force des interactions entre biomolécules. Plus la valeur K_D est basse, plus l'affinité de liaison entre le ligand et sa cible est élevée. Plus la valeur K_D est élevée, plus l'attraction et la liaison de la molécule cible au ligand sont faibles. 

L'affinité de liaison est influencée par les interactions non covalentes entre biomolécules, telles que les liaisons hydrogène, les interactions électrostatiques et hydrophobes et les forces de Van der Waals entre les deux molécules. De plus, l'affinité de liaison entre un ligand et sa molécule cible peut être affectée par la présence d'autres molécules.

Lors de la caractérisation des protéines, des acides nucléiques et de toute autre biomolécule, la compréhension de l'affinité de liaison aux substrats, aux inhibiteurs et aux cofacteurs est cruciale pour l'évaluation des interactions moléculaires et pertinente dans le cadre, par exemple, de l'étude des réactions enzymatiques, des complexes protéiques ou des liaisons aux récepteurs. Concernant la recherche de médicaments, l'affinité de liaison aide à créer des produits qui se lient à leur cible selon des mécanismes sélectifs et spécifiques.

De nombreuses méthodes existent afin de mesurer l'affinité de liaison : des méthodes qualitatives (p. ex., liaison : oui/non) telles qu'ELISA et les essais de retard sur gel, ainsi que des méthodes quantitatives (p. ex., affinité de liaison) telles que les tests spectroscopiques, les biocapteurs optiques (p. ex., GCI) et la titration calorimétrique isotherme.

Il existe de nombreuses façons de mesurer l’affinité de liaison, y compris les méthodes qui nécessitent que les interactions soient marquées et les approches sans marquage. La principale méthode qualitative étiquetée (c'est-à-dire liaison : oui/non) est le test immuno-enzymatique (ELISA). Les principales méthodes quantitatives sans étiquette comprennent les analyses spectroscopiques, la calorimétrie par titrage isotherme (ITC) ou les biocapteurs optiques tels que la résonance plasmonique de surface (SPR), l'interférométrie de biocouche (BLI) et l'interférométrie couplée à un réseau (GCI).

Dosage immuno-enzymatique (ELISA)

ELISA est une technique de test sur plaque qui utilise un ligand immobilisé pour capturer un analyte cible à partir d'une solution et utilise des réactifs de détection spécialisés (les marqueurs) pour analyser la réaction entre les deux molécules.

Résonance plasmonique de surface (SPR)

SPR est une technique de détection optique sans étiquette qui détecte les interactions moléculaires lorsque l'indice de réfraction change dans un champ évanescent localisé du plasmon de surface. Les canaux microfluidiques permettent des mesures plus précises.

Interférométrie de biocouche (BLI)

BLI utilise un biocapteur optique pour mesurer les changements dans le modèle d’interférence de la lumière réfléchie par la pointe du biocapteur. La pointe du biocapteur est généralement recouverte d'une molécule de capture et plongée dans une solution échantillon contenant l'analyte d'intérêt. BLI est sans étiquette.

Interférométrie couplée à un réseau (GCI)

GCI est une technique de détection optique sans étiquette qui consiste à coupler un échantillon et un faisceau de référence dans un guide d'ondes à fibre optique. L'affinité de liaison et la cinétique sont analysées en mesurant les signaux de déphasage dépendant du temps qui résultent de l'interaction.

Calorimétrie par titrage isotherme (ITC)

ITC mesure le changement de chaleur associé à l'interaction de liaison et détermine sa stœchiométrie et sa thermodynamique de liaison.

Quelle que soit la manière dont vous mesurez l'affinité de liaison, la mesure entraînera plusieurs points de rapport, à partir desquels une courbe d'affinité de liaison peut être créée. Cette courbe dépend à la fois de la concentration de l'échantillon et de l'interaction entre l'échantillon et la cible.

Il est donc important de connaître la concentration de votre échantillon et de considérer la bonne période d’incubation, en plus de vos contrôles expérimentaux réguliers et appropriés. Il est particulièrement important d’atteindre l’équilibre (où la quantité de molécules se liant à la cible est la même que la quantité qui se dissocie de la cible) pendant votre test. Sans atteindre l’équilibre, vous ne pouvez pas déterminer l’affinité de manière fiable, car le modèle de liaison ne peut pas être ajusté de manière fiable.

Apprenez-en davantage dans notre guide cinétique.

Malvern Panalytical propose à la fois une solution d'interférométrie couplée à un réseau (GCI) et une solution de titration calorimétrique isotherme (ITC). Ces deux techniques sont sans marquage, ce qui permet l'utilisation de molécules natives. Une affinité hautement quantitative (valeurs K_D) peut être obtenue à partir de ces deux techniques pour une large gamme d'interactions.

La GCI est une méthode optique qui mesure la variation de l'indice de réfraction dans un champ évanescent causée par l'événement de liaison. Elle est utilisée dans le cadre de l'étude de l'affinité et de la cinétique d'une interaction. La GCI permet de mesurer les valeurs K_D du millimolaire au picomolaire et détermine également la cinétique d'une interaction ; plus particulièrement, les constantes d'association et de dissociation (respectivement k_a et k_d).

L'ITC permet de mesurer la variation de température associée à l'événement de liaison. L'ITC permet de mesurer les valeurs K_D du millimolaire au nanomolaire et détermine la stœchiométrie et la thermodynamique de liaison de l'interaction. La cinétique et la thermodynamique sont toutes deux importantes dans la caractérisation des interactions moléculaires. 

L'affinité des deux dispositifs est orthogonale. Ensemble, elles peuvent assurer la confiance lorsqu'une valeur K_D hautement quantitative est requise, entre autres dans le cadre des applications d'optimisation des leads. 

La GCI bénéficie d'une sensibilité et d'un rendement plus élevés ainsi que d'une consommation d'échantillons plus faible. Elle démontre aussi des performances satisfaisantes avec les échantillons bruts. Si ces facteurs et l'information cinétique prévalent dans votre application, alors votre choix est tout fait. 

Si les données thermodynamiques (enthalpie et entropie) et la stœchiométrie prévalent, alors l'ITC est la meilleure solution. L'ITC bénéficie aussi d'une mise au point minimale et peut donc atteindre un résultat plus rapidement si seul un petit nombre de mesures pour une paire d'interactions donnée est anticipé. Il s'agit également d'une technique non destructive. L'échantillon peut donc être récupéré après l'expérience. 

Les systèmes WAVEsystem (GCI) et MicroCal PEAQ-ITC sont tous deux conçus en prenant en compte les besoins de l'utilisateur et sont reconnus pour leur facilité d'utilisation dans leurs catégories d'instruments respectives.