蛋白质稳定性对生物技术药物开发的成功或失败至关重要。 蛋白质稳定性在生产、制造、制剂、长期储存、传递给患者和发挥疗效过程中是非常重要的参数。 高度稳定的蛋白质在生产过程中可能会遇到的问题更少，更具成本效益，更易于在制剂和储存期间保持功能性，而不会发生化学改变或聚集。 在生物技术药物开发的“质量源于设计”(QbD) 方法中，稳定性表征是潜在候选药物的“开发可行性”或“成药性“评估以及流程开发和生产的一部分。 稳定性数据还整合到用于生产支持、生物相容性和生物相似性的高级结构 (HOS) 表征和“指纹图谱”中。 对于新生物技术药物和生物仿制药，蛋白质 HOS 表征日益有望成为注册申报中的纳入标准。
由于蛋白质的复杂性，生物物理工具对于生物技术药物产品的完全表征非常重要。 现在，有多种生物物理工具用于蛋白质稳定性的评价，包括但不限于：圆二色光谱 (CD)、动态和静态光散射法 (DLS 和 SLS)、尺寸排阻色谱-多角度光散射 (SEC-MALS)、傅里叶变换红外光谱 (FTIR)、分析性超滤 (AUC)、尺寸排阻色谱法 (SEC)、差示扫描荧光 (DSF)、内源荧光 (IF) 和差示扫描量热法 (DSC)。
虽然所有这些生物物理试验在生物技术药物开发中都具有非常重要的作用，但通过 DSC 表征热稳定性是最关键的。 在一篇 2015 年有关用于单克隆抗体高级结构表征的生物物理技术文章中，Gokarn 等 表明：“DSC 仍是在给定缓冲液条件下评价蛋白质热力学稳定性的无与伦比的技术”[1]。
本白皮书着重描述使用 DSC 表征蛋白质生物技术药物（主要是抗体）的热稳定性，并作为 HOS 表征工具用于生物技术药物可比性研究（批次间比较、流程更改的影响等），以及用于生物仿制药的开发。
DSC 是用于表征蛋白质、核酸、脂类和其他生物聚合物的热稳定性和构象稳定性的微量热法[2-7]。 DSC 测量热容作为温度函数。 DSC 仪器用于蛋白质表征，在本白皮书中描述为“功率补偿”仪器，其中溶液中的生物聚合物置于固定样本池中，而对应缓冲液置于匹配的参比池内。 来自样本池的热容 (Cp) 信号与来自参比池的信号进行比较。 随着两个池中的温度升高，参比池和样本池之间的温度差将会持续测量并校准为功率单位。 DSC 是一种“强制降解”试验，随着蛋白质暴露到不断升高的温度中，蛋白质开始去折叠，且蛋白质的 Cp 升高（图 1）。
图 1：DSC 的工作原理。 热容 (Cp) 随蛋白质热变性变化。 DSC 实验开始时的温度下，蛋白质主要处于其自然构象中折叠的状态。 随着温度升高，在某些点蛋白质将开始去折叠/变性 (Tonset)（热分解起始温度）且 Cp 升高。 在 50% 的蛋白质处于自然构象而 50% 已变性的温度下，Cp 将达到其最大值 - 这就是热转变中点或 TM。 高于 TM，蛋白质将主要发生变性，且在 DSC 实验结束时，所有蛋白质都将处于去折叠构象。 用于 DSC 的实验参数包括 Tonset、TM 和去折叠焓 (ΔH)。
DSC 直接测量热容改变、不需要任何荧光或任何其他标签或探针。 对于可逆变性的蛋白质，热转变中点 (TM)，也称为熔解或变性温度，其中 50% 处于自然（折叠）构象，而 50% 处于变性构象。 TM 被看作 DSC 热谱图的“峰”。
TM 被认为是热稳定性的良好的表示 – TM越高，蛋白质的热稳定性越好。 多结构域蛋白质（如抗体）通常在 DSC 热谱图上有多个峰，因此可能确定多个 TM（参见图 2）。
图 2：单克隆抗体的代表性 DSC 热谱图，确认出 CH2、Fab 和 CH3 结构域。 红色虚线为每个结构域转变的去卷积峰，标名三个 TM。
DSC 提供其他有用参数，这些参数可用于表征和排序蛋白质稳定性，包括由曲线下面积测量得出的去折叠焓 (ΔH)。 蛋白质去折叠是一个吸热过程，这是由于保持蛋白质折叠的二级非共价键断裂需要吸收热量。 DSC 还确定 Tonset（去折叠起始）、∆Cp（去折叠的热容改变）、T1/2（1/2 峰高度处的宽度，指示去折叠热谱图的形状）。 DSC 分析可包括确定这些参数的任何组合。
大多数蛋白质变性不可逆，并倾向于在热变性后聚集或沉淀。 TM 和其他来自变性不可逆性蛋白质 DSC 分析的参数不是真正的热力学参数。 但是，来自不可逆性变性蛋白质 DSC 分析的 TM 排序对于定性参数稳定性筛选非常有用。
马尔文仪器提供 MicroCal VP-Capillary DSC 系统[8,9]，为设计用于 TM 筛选和热力学表征溶液中蛋白质和生物聚合物的自动化 DSC。
图 3：生物技术药物发现和开发流程的总体方案
图 3 显示生物技术药物发现和开发流程的总体方案。 绿色部分为生物物理表征（包括稳定性实验）最常用的点（在本白皮书结束部分为有关生物技术药物发现和开发的“补充阅读资料”列表）。
为开发所需生物技术药物，科学家在候选药物选择过程中最初寻找已显示出高稳定性的生物分子，并可能需要通过蛋白质工程带来提高的稳定性。 在纯化过程中，要从蛋白质稳定、正确折叠和有活性的条件中去除蛋白质，因此使用可尽可能在此过程中保持蛋白质稳定的缓冲液、助剂、纯化方法和储存条件非常重要。
配制的皮下注射 (SC) 蛋白质药物在非常高的蛋白质浓度时（有时约 100 mg/mL）在其密封容器（如小瓶或载药注射器）内必须稳定并不受影响持续几年。 如热、化学品、pH 改变、压力、混合和高浓度等的应激源在生物技术药物生产和制剂过程中可能发生，当蛋白质分子暴露在这些应激源下时，其构象会偏向形成变性（去折叠）蛋白质。 溶液中的蛋白质还对如脱酰胺作用和氧化作用的修饰敏感，这类作用可导致变性、无活性蛋白质。 就蛋白质生物技术药物而言，变性和其他修饰可导致聚集形成，进而导致产品疗效降低或成为无效药品。 更重要的是，蛋白质聚集可导致患者发生可能致命的免疫反应。 使用稳定蛋白质作为生物技术药物的基础可使生产成本更低效益更大，并带来成功的、有效安全的药品。
氨基酸序列、或蛋白质一级 (1°) 结构是多肽链和蛋白质结构的最基本组件。 除此以外，明白和表征蛋白质的三维结构（也称为高级结构 (HOS)）非常重要。 蛋白质 HOS 有三个水平：二级 (2°)，是指蛋白质初级结构的局部折叠方式，包括 α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲；三级 (3°)是指由大量二级结构元素构成的最终蛋白质三维结构；四级 (4°)，描述涉及两条或更多相同或不同的多肽链相互作用构成的结构。
DSC 是构象稳定性和三级、四级结构改变（当蛋白质热变性时发生）的度量，以及提供内在和外在因素如何影响蛋白质稳定性的指示。 DSC 被认为是生物技术药物蛋白质表征中的最佳、定量最好的热稳定性分析，并常用作长期稳定性的预测指标[1,10-14]。 来自 DSC 的 TM 频繁用于在候选药物选择中排序稳定性（开发可行性）、制剂筛选和流程开发，越稳定的蛋白质拥有更高的 TM。 来自 DSC 的 (ΔH)、Tonset、T1/2 和 ΔCp 也用于排序稳定性、验证 DSC 数据、定量分析蛋白质去折叠、和“指纹图谱”高级结构[10-14]。
如果蛋白质相同或高度相似，定义溶液条件下蛋白质的 DSC 分析可定量并可重复（图 4）。 即，DSC 热谱图将会有可重复的模式，且参数（包括 TM、ΔH 和 Tonset）将会位于可接受范围内[12-14]。 如果比较的热谱图不同且 DSC 符合参数改变，这就表明已发生如蛋白质错误折叠、降解、聚集、容积改变、翻译后修饰或其他高级结构改变的事件，影响蛋白质的构象稳定性。
可重复和定量数据使得 DSC 成为用于在生产（包括批次间和工厂间可比性）、蛋白质变异体与修饰产物（包括由醣基化作用和氧化作用造成的结构变化）比较、以及生物相似性产品过程中评价产品的可比性和 HOS 分析中的关键试验。 DSC 数据还可在监管支持文档作为新药物和生物相似性申报的 HOS 表征中使用。 在一项生物技术药物行业科学家的调查中，DSC 排列为对于在候选药物选择、制剂开发、产品表征、可比性、流程开发和生物相似性中“及其有用”的 HOS 生物物理工具“非常有用”[15]。
图 4：19 个 PBS 中牛血清白蛋白的 DSC 热谱图（Sigma A1933，色谱纯化）。 DSC 数据在扫描速率标准化、缓冲液-缓冲液减法以及集成基线减法后显示。 显示 Tonset、TM1 和 TM2 的均值和标准差。
对于多结构域蛋白质（如抗体），DSC 热谱图存在多个去折叠转变（图 2 所示）。 DSC 可表征和定量不同结构域，并为每个转变确定单独的 TM。 TM 值由热谱图峰代表，并可从 DSC 数据简单确定，无需复杂数据分析。 可确定 TM 的其他生物物理试验，如 CD、IF 和 DSF 仅可检测第一个 TM（产生于最低温度时），或多结构域蛋白质最“主要”TM。 从光谱和荧光数据提取多个 TM 需要复杂的数据拟合，且可能不具备可重现性。
与其他 TM 筛选试验比较，DSC 确实每次扫描需要更多蛋白质样本，且通量更低。 如果样本有限，一个较好的解决办法是使用 DSF 或 IF 执行 TM 排序，随后选择几个样本以使用 DSC 验证 TM。 使用 DSC 验证 TM 结果非常重要，且在稳定性试验中不仅仅依赖于荧光或光谱计算 TM 来评价稳定性。 在基于荧光的试验看到干扰输出的伪影非常常见，且 TM 结果很可能会由于这些伪影移至更高（或更低）的值。 一些蛋白质和缓冲液条件与荧光不兼容，这可导致 TM 差异的计算非常复杂。 最后，荧光和光谱无法确定量热焓和其他热力学参数，而 DSC 可提供所有此类信息作为热稳定性“数据套件”。
DSC 被公认为生物制药行业中热稳定性试验的金标准，原因是其拥有如下技术：
测量与蛋白质去折叠相关的热改变
直接测量蛋白质去折叠，因此无需标签、探针或标记。 这意味着没有可能检测到的伪影，而在荧光或其他光谱方法中通常可见伪影
测量溶液中的自然状态蛋白质，并可用于常用于生物技术药物纯化和制剂的几乎所有缓冲液和助剂。 其中一些缓冲液和助剂于荧光或光谱不兼容
易于用于实验设置
温度控制高度精确，工作温度范围高至 130°C，因此可检测大多数高 TM 转变。 其他 TM 筛选试验仅可加热样本至 100°C（或更低）
这是一种“强制降解“试验，因此不需要在分析前在缓冲液中储存的蛋白质。 SEC-HPLC 和 DLS 通常要求在温度升高的条件下在缓冲液中孵育样本来检测构象变化。
拥有简单数据输出和集成式数据分析软件
可用于分辨单独的去折叠转变和表征多结构域蛋白质和蛋白质复合物以及简单的单结构域蛋白质
所含信息丰富：提供热动力学数据构以及构象稳定性和 TM 确定。
可用作生物技术药物热稳定性表征的首要试验，还可与其他正交或互补生物物理筛选工具配合使用，和/或验证其他数据
可用于热稳定性快速自动化筛选的高通量自动化分析（MicroCal VP-Capillary DSC 系统）
生物技术药物可比性
单克隆抗体和其他生物技术药物药物是由哺乳动物或细菌细胞表达的复合蛋白质。 每种蛋白质都是独一无二的，并需要大量研究、表征和优化以转化为药物。 作为发现和早期开发的部分，蛋白质药物的所需特性已定义，包括纯度、效价和剂量。 已发展了生物化学、生物物理和生物学试验来研究这些特征，并在整个产品开发过程中进行了优化。
为每一流程进行了详细蛋白质表征和 HOS（包括稳定性）以定义在整个产品生命周期中控制和验证流程所需的蛋白质关键品质特性和关键流程参数。 在生物技术药物开发的“质量源于设计”(QbD) 方法中，关键品质特性和稳定性表征是流程开发和生产支持过程中药物评价的一部分[16,17]。
在蛋白质药物处理过程中，蛋白质暴露在不同条件下，包括：
不同溶液，包括不同缓冲液、pH 和盐类
制剂助剂（辅料）
蛋白质浓度范围
反复冻融循环、增加的压力及混合/搅动
与蛋白质接触的不同材料表面（泵、超滤膜/渗透膜、色谱介质等）
暴露于氧化剂、蛋白酶、细胞培养基、产品变异体等。
任何这些条件都可干扰保持蛋白质处于自然状态折叠构型的力和相互作用，导致变性或无活性蛋白质。 由于氧化作用、脱酰胺作用、醣基化作用中变化或其他翻译后修饰造成的化学变性也会发生。
变性蛋白质通常形成聚集，这对于生物技术药物开发是关键问题。 聚集是蛋白质单体的关联状态，且聚集形成可以可逆或不可逆，大小范围从蛋白质二聚体到肉眼可见的大颗粒。 至少，蛋白质聚集会降低药物疗效和效价，并将增加生产成本。 有关蛋白质聚集和颗粒的更大担忧是其可能会引起免疫原反应，免疫原反应在极端病例中会导致患者死亡。 由于这些问题，在生物制药行业内对蛋白质聚集进行了大量仔细检查。 这包括颗粒/聚集检测、生产和制剂过程中的定量和表征以及查找在生物技术药物产品中减少或消除蛋白质聚集的解决方法。
证明生产的蛋白质药物在结构、稳定性、粒径分布和生物化学和功能性实验中与以下内容有可比性非常重要：
前一批次和参比蛋白质批次中生产的相同蛋白质
在不同机构生产的蛋白质
使用修改后的上游或下游流程生产的相同蛋白质
上游或下游流程的规模扩大
在不同制剂中的蛋白质
可比性（或生物相容性）的生物化学、生物物理、HOS 和功能性试验设计以证明与参比蛋白质相比，生产的蛋白质产品在指定的关键品质特性中“高度相似”。 在开发的每一阶段仔细分析蛋白质候选药物的 HOS 至关重要。
生物技术药物生产流程的改变可能发生在流程开发过程中和药物批准后。 这类改变的原因包括：
生产流程改进（如产品良率、降低成本）
规模增加
生产场所改变
合规性和法规改变
产品稳定性提升
当生产流程进行了重大改变时，应实施可比性研究以评价更改对关键品质特性、生物技术药物产品安全性和疗效的影响。 可比性证明的不一定表示改变前和改变后产品的关键质量特性完全一样，而是高度相似。 生产改变不应对产品质量有负面影响。
可比性时蛋白质治疗药物的重要事项，也是多个国际监管机构强调的事项[18,19,20]。 没有单个分析方法可用于蛋白质药物的可比性评价。 HOS 和可比性研究包括（但不限于）：DSC、DLS、荧光、CD、AUC、SEC、拉曼光谱、纳米粒子跟踪分析（来自马尔文 Instruments 的 NanoSight）、共振质量测量（来自马尔文 Instruments 的 Archimedes）和显微镜法。 还使用生物实验、等温滴定量热法 (ITC) 和表面等离子共振 (SPR) 监测蛋白质生物活性和疗效。
每种生物物理方法提供的信息都是特定的，而当一同评价时可提供用于 HOS 表征和可比性的结构信息。 HOS“图谱”帮助在流程开发周期、批次间可比性期间扩大规模时，流程转到新生产场所时，以及生产被修改时确保蛋白质结构的一致性。 来自 HOS 表征的信息对评价生物仿制药也非常有价值。
注意生产流程（或改变）过程中的测试和构建可比性与在生物相似性药品开发期间执行的测试不完全相同 – 生物仿制药开发是复杂得多的过程。 由于生物相似性通常不由开发原研药（也称为母体或参比产品）的同一公司生产，生物仿制药开发需要“反向工程”来建立新的上游和下游流程。 生物仿制药生产商必须在原研药商品的狭窄范围内匹配产品品质（生物相似性），需要比在生产过程中显示可比性通常需要的更多的生物物理和生物化学证据来证明生物相似性。
由于 DSC 提供有关蛋白质在不同溶剂条件下热稳定性的信息，且 DSC 结果可重复（图 4），DSC 常包含在可比性研究中以显示流程不会导致产品稳定性改变，且不同批次和/或生产场所生产的产品高度相似。
Jiang 和 Nahri[21] 回顾了用于流程开发和生产过程中可比性研究的几种生物物理技术。 他们引用 DSC 作为由两种不同细胞系（细胞系 1 和 2）表达的单克隆抗体药品的生物物理表征工具之一，该药品的生产流程也有所改变（流程 2pA 和 2pB）。 这三种生成的蛋白质产品通过 FTIR（以确定二级结构）、近紫外圆二色谱和内源荧光（以比较三级结构）荧光和 ANS 结合（以比较表面疏水性）、DLS（以比较流体力学特征）、以及 DSC（以比较热稳定性和可溶性）进行了评价。
来自该组生物物理试验的结果表明这三种样品的总体二级和三级结构相似。 DSC 结果指示与 2pA 样品和细胞系 1 样品比较，来自细胞系 2pB 的蛋白质的热稳定性显著升高。 根据 DSC，2pA 和细胞系 1 样品也显示出了更多异质性。 正常情况下，抗体可以看到 2 到 3 转变（有关“典型”抗体 DSC 热谱图的示例请见图 2）。 根据这些样本的 DSC 分析，存在更多数量的重叠热转变指示样品异质性。 DSC 结果表明流程改变提升了感兴趣单克隆抗体的同质性和稳定性。 基于本文章中讨论的生物物理、生物化学和功能性试验可比性数据，细胞系 2 和流程 2pB 被视为可生产更稳定的蛋白质[21]。
来自 Jiang 和 Nahri[21] 的第二个示例，研究使用 DSC 观察在不同生产场所生产的蛋白质产品的可比性。 蛋白质 Y 由两条单体多肽链构成，通过分子的 Fc 区域以双硫键结合。 在其开发过程中，蛋白质 Y 在不同场所生产。 为验证这些不同批次的蛋白质在自然构象、二级和三级结构、热稳定性和粒径分布中是可比的，蛋白质 Y 的四种不同样本（代表在不同机构生产的三种样品）以及参比蛋白质标准通过 FTIR、远紫外圆二色谱、近紫外圆二色谱、荧光、DSC 和 AUC 进行了分析。
来自不同生产场所的参比标准和 3 种样品的 DSC 扫描显示每个样品有两个热转变，且所有四个 DSC 曲线在实验变异内完全相同。 这表明这些蛋白质样本的热稳定性没有差异，且都折叠为自然构象。 联合生物物理表征结果（包括由 DSC 生成的数据）证明所有四种蛋白质 Y 样品都可比，有适当的二级和三级结构，且都同质[21]。
如果 DSC 热谱图不完全相同，可能指示了翻译后修饰变化或蛋白质发生了化学变性，与制剂流程相关。 Arthur 等[22] 证明了在稳定性改变（来自氧化作用 - 一种常见的化学降解通路）的 HOS 检测中 DSC 的灵敏度。 如果生物技术药物产品在最终制剂的纯化或储存过程中受到氧化作用，可对疗效造成负面影响，并还增加了蛋白质聚集形成的可能性。 在本研究中，来自三种结构类型的蛋白质产品在多个氧化水平进行了评价。 每种蛋白质显示出在蛋氨酸氧化作用下 TM 线性降低；作者还观察了结构类型之间和结构类型内的 TM 变化率的差异，以及结构域 TM 稳定性差异[22]。 对比而言，近紫外圆二色谱和荧光光谱对氧化作用诱导的构象变化的灵敏度要低得多 - 与这些光谱方法相比，DSC 是一种更合适的用于监测蛋白质氧化的结构表征方法[22]。 对于本研究中的一种蛋白质 (IgG2B)，通过 DSC 检测到先于相对效价丢失的 TM 变化，证明 DSC 是抗原结合力降低的领先指标。 通过质谱 (MS) 可检测到的氧化蛋氨酸变化发生在低于带可检测构象或功能性影响的氧化水平。 将来自 DSC 的 TM 位移与 MS 和效价方法配合使用，初级结构修饰、HOS 中变化和构象稳定性以及功能性影响之间的关系能够获得可靠表征。
Morar-Mitrica 等[12] 描述了几个将 DSC 整合到 HOS 和生物技术药物可比性研究中的案例研究，包括通过可观察 TM 位移的单克隆抗体氧化作用表征（类似于 [22] 中所述内容），可重复 DSC 热谱图曲线，和将 TM、 T1/2、Tonset 和 ∆H 用于生物技术药物的可比性研究，以及不同糖基化（一种常见的翻译后修饰）水平的糖基化单克隆抗体的扩展 DSC 表征。
Shahrokl 等[23] 讨论 DSC 在作为生物制品许可申请一部分的可比性研究中如何有用，提到了 DSC 易于使用，且数据输出简单。 作者描述了 DSC 如何在其生产流程改变前后用于 51 kDa 糖化蛋白质的可比性研究。 实施流程改变旨在增加产品良率并去除来自细胞培养基的动物来源物质。 使用 DSC，作者评价了使用每个生产流程生产的三个批次的糖化蛋白质，并观察到 DSC 热谱图可叠加以及显示出在 60.7 °C +/- 0.1 °C 处的单一转变。 DSC 结果显示生产改变未对糖化蛋白质的构象稳定性造成影响[23]。
Lubiniecki 等[24] 通过对两种不同的 IgG1 候选单克隆抗体（抗体 A 和抗体 B）执行三种可比性研究，评价了产品开发过程中生产改变对抗体结构和功能的影响。 两项可比性研究将 DSC 整合作为一种生物化学和生物物理分析工具。 一项研究观察了流程规模扩大和转移到生产场所，以及从冻干粉变为液体剂型。 抗体 A 和抗体 B 的冻干和液体制剂 DSC 热谱图显示良好相关性[24]。 DSC 与 MS、CD、SEC 和其他测试一起使用，显示生产变化未导致抗体结构或功能改变。
第三项可比性研究评价了载药注射器或小瓶中的抗体液体制剂[24]。 来自 DSC、CD、SEC 和其他试验的结果表明相似的分子结构、生物活性和降解曲线。 一个明显的例外为载药注射器中显微镜可见级别颗粒较小（但显著）的增加[24]。
生物仿制药产品（也称为“后续生物制品”或“生物类似药”）是一种监管机构基于其对于以前批准的生物产品（称为参比产品，也称为母体或原研药）的相似性批准的生物技术药物。 生物仿制药多年来在全球均有批准[25-29]。 在本白皮书撰写的时候（2016 年 10 月），美国食品药品监督管理局批准了四种生物仿制药，而 EMEA 批准了 19 种生物仿制药。
注意开发生物仿制药与通用小分子药物开发不同。 小分子药物为化学品，且小分子药物的合成为受控过程。 由于生物技术药物通常为蛋白质。 一定有一定程度的蛋白质变异，即使在不同批次的相同产品之间，因为生物表达系统和生产过程的固有变异性。 这些变异可包括翻译后修饰和 HOS 中的差异。 由于蛋白质的高分子量、复合结构和自然变异体，生物仿制药的生产不像通用药那样简单。 生物仿制药不是参比产品的完全复制品，由于这个原因其通常表征为与参比产品“相似”或“高度相似”。
生物仿制药的开发涉及参比蛋白质和生物仿制药的物理化学、分析和功能性比较。 这些试验由比较非临床和临床数据进行补充，以建立同等疗效和安全性。 批准前，必须验证生物仿制药在与参比产品安全性和有效性的比较没有临床意义上的差异。 生物仿制药产品仅允许临床无效组分中有微小差异。 对于相同的批准适应症，生物仿制药预计与参比产品的工作原理完全相同。
监管机构基于其相对于参比产品的生物相似性水平来评价生物仿制药。 由于生物技术药物的复杂性，两个不同的生产商不太可能生产两种完全一样的产品，即使采用完全一样的表达系统、流程和等同技术。 因此，生物仿制药生产商需要如上所述的依赖可比性研究和 HOS 分析[30,31]。 生物仿制药开发对增多的分析信息的需求，以及对压缩的时间线的需求要求在每一阶段（尤其在生产过程中）证明相对于参比分子的可比性。
生物仿制药必须经“逆向工程”以尽可能匹配参比产品。 生物仿制药的分析表征包括初级和高级结构（二级、三级和四级）评价，生物活性以及产品和过程杂质分析。 DSC 通常用作 HOS 生物物理试验以显示与参比产品相比，生物仿制药拥有高度相似的 DSC 曲线“指纹”，以及相似的 TM、Tonset 和其他热动力学参数。
美国食品药品监督管理局批准了四种生物仿制药中的三种（2016 年 10 月），将 DSC 纳入 FDA 归档的 HOS 测试之一：
Erelzi（来自 Sandoz, Inc.）是 Amgen’s Enbrel (etanercept) 的生物仿制药[32]
Inflectra（来自 Celltrion），在其他市场成为 Remsima，是 Janssen’s Remicade (infliximab) 的生物仿制药[33,34]
Amjevita（来自 Amgen）是 Abbvie’s Humira (adalimumab) 的生物仿制药[35,36]
Sinha-Datta 等[37] 证明了 DSC (MicroCal VP-Capillary DSC) 和表面等离子共振 (SPR) 作为分析工具（基于热稳定性、动力学和效价），可用于比较两种治疗性单克隆抗体（mAb1-i 和 mAb2-i）及其生物仿制药（mAb1-B 和 mAb2-B1、B2、B3）。 他们观察到在 SPR 结果的生物功能方面，生物仿制药就与其参比样品高度相似。 DSC 用作母体和生物仿制药之间生物相似性的另一确认方法。 DSC 分析显示母体和生物仿制药的结构相似性良好，主要 TM 位于 84.1°C （对于 mAb1）和 72.8°C （对于 mAb2）。
本白皮书中呈现的信息证明了将 DSC 整合为用于生物技术药物可比性和生物相似性表征的生物物理稳定性和 HOS 试验的重要性和价值。 使用 DSC 结果以及其他生物物理和生物化学试验，生物制药公司可在生产过程中明智选择蛋白质稳定性和可比性，确保每批次的蛋白质与参比批号均高度相似，且任何流程或生产变化不影响构象蛋白质稳定性。 DSC 还被纳入为生物相似性开发的 HOS 试验，以帮助证明生物仿制药与原研药“高度相似”。
Analytical Techniques for Biopharmaceutical Development, R. Rodriguez-Diaz, T. Wehr, S. Tuck (eds.), Taylor & Francis, New York, NY, USA (2005).
Biophysical Characterization of Proteins in Developing Biopharmaceuticals, D.J. Houde, S.A. Berkowitz (eds.), Elsevier, Amsterdam, Netherlands (2015).
Biophysical Methods for Biotherapeutics: Discovery and Development Applications, T.K. Das (ed.) John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USA (2014).
Biophysics for Therapeutic Protein Development, L.O. Nahri (ed.), Springer, New York, NY, USA (2013).
State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 1. Monoclonal Antibody Therapeutics: Structure, Function, and Regulatory Space, J.E. Schiel, D.D. Davis, O.V. Borisov (eds.), ACS Symposium Series Vol 1176 (2014). doi: 10.1021/bk-2014-1176.
State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 2. Biopharmaceutical Characterization: The NISTmAb Case Study, J.E. Schiel, D.D. Davis, O.V. Borisov (eds.), ACS Symposium Series Vol 1201 (2015). doi: 10.1021/bk-2015-1201.
State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 3. Defining the Next Generation of Analytical and Biophysical Techniques, J.E. Schiel, D.D. Davis, O.V. Borisov (eds.), ACS Symposium Series Vol 1202 (2015) DOI: 10.1021/bk-2015-1202.
1. Gokarn, Y., Agarwal, S., Arthur, K., et al., Biophysical Techniques for Characterizing the Higher Order Structure and Interactions of Monoclonal Antibodies, in: State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 2. Biopharmaceutical Characterization: The NISTmAb Case Study. J.E. Schiel, D.D. Davis, O.V. Borisov (eds.), ACS Symposium Series Vol 1201, American Chemical Society, Washington DC, USA, pages 285-327 (2015).
2. Cooper, A., Nutley, M. A., and Wadood, A., Differential Scanning Calorimetry, in: Protein-Ligand Interactions: Hydrodynamics and Calorimetry, A Practical Approach, S.E. Harding, B.Z. Choudry (eds). Oxford University Press, Oxford, UK, p. 287-318 (2001).
3. Malvern Instruments Whitepaper “Differential Scanning Calorimetry (DSC) Theory and Practice” http://www.malvern.com/en/support/resourcecenter/Whitepapers/WP140701-dsc-theory-and-practice.aspx.
4. Bruylants, G., Wouters, J., and Michaux, C., Current Med. Chem. 12, 2011-2020 (2005) doi: 10.2174/0929867054546564.
5. Jelesarov, I., and Bosshard. H.R., J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999) doi: 10.1002/ (SICI)1099 1352(199901/02)12:1<3:AID-JMR441>3.0.CO; 2-6.
6. Choi, M.H., and Prenner, E.J., J. Pharm. Bioallied Sci. 3, 39-59 (2011) doi: 10.4103/0975-7406.76463.
7. Johnson, C.M., Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013) doi: 10.1016/j.abb.2012.09.008.
8. Plotnikov, V., Rochalski, A., Brandts, M., Brandts, J.F., Williston, S., Frasca, V., and Lin, L.N., Assay Drug Devel. Technol. 1, 83-90 (2004) doi:10.1089/154065802761001338.
9. www.malvern.com
10. Demarest, S.J., and Frasca. V., Differential Scanning Calorimetry in the Biopharmaceutical Sciences, in: Biophysical Characterization of Proteins in Developing Biopharmaceuticals, D.J. Houde, S.A. Berkowitz (eds.), Elsevier, Amsterdam, Netherlands, p. 287-306 (2015).
11. Remmele, R.L., Microcalorimetric Approaches to Biopharmaceutical Development, in: Analytical Techniques for Biopharmaceutical Development, R. Rodriguez-Diaz, T. Wehr, S. Tuck (eds.), Taylor & Francis, New York, NY, USA, p. 327-381 (2005).
12. Morar-Mitrica, S., Nesta, D., and Crofts, G., BioPharm Asia 2, 46-55 (2013).
13. Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., and Carpick, B., Pharm. Bioprocess. 2, 491-498 (2014) doi: 10.4155/PBP.14.27.
14. Wen, J., Arthur, K., Chemmalil, L., Muzammil, S., Gabrielson, J., and Jiang, Y., J. Pharm. Sci. 101,955-964 (2012) doi: 10.1002/jps.22820.
15. Gabrielson, J.P., and Weiss, W.F., J. Pharm. Sci. 104, 1240-1245 (2015) doi: 10.1002/jps24393.
16. Cooney, B., Jones, S.D., and Levine, H., BioProcess Int. 14(6), 28-35 (2016). http://www.bioprocessintl.com/analytical/upstream-development/quality-by-design-for-monoclonal-antibodies-part-1-establishing-the-foundations-for-processdevelopment/
17. Cooney, B., Jones, S.D., and Levine, H., BioProcess Int. 14(8), 24-33 (2016). http://www.bioprocessintl.com/2016/quality-design-monoclonal-antibodies-part-2-process-design-space-control-strategies/
18. http://www.who.int/biologicals/biotherapeutics/rDNA_DB_final_19_Nov_2013.pdf
19 http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003935.pdf
20. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM496611.pdf
21. Jiang, Y., and Nahri, L.O., J. Am. Pharm. Rev. 9, 34-43 (2006).
22. Arthur, K.K., Dinh, N. , and Gabrielson, J. P., J. Pharm. Sci. 104, 1544-1554 (2015) doi: 10.1002/jps.24313.
23. Shahrokh, Z., Salamat-Miller, N., and Thomas, J.J., Biophysical Analyses Suitable for Chemistry, Manufacturing, and Control Sections of the Biologic License Application (BLA), in: Biophysical Methods for Biotherapeutics: Discovery and Development Applications, T.K. Das (ed.) John Wiley & Sons, Hoboken NJ USA pages 317-353 (2014).
24. Lubiniecki, A., Volkin, D.B., Federici, M, et al., Biologicals 39, 9-22 (2011). doi: 10.1016/j.biologicals.2010.08.004.
25.http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/ApprovalApplications/TherapeuticBiologicApplications/Biosimilars/
26.http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/01/WC500180219.pdf
27.http://www.who.int/biologicals/areas/biological_therapeutics/BIOTHERAPEUTICS_FOR_WEB_22APRIL2010.pdf
28 Bas, T.G., and Oliu Castillo, C., Biomed Res Int. 2016, 5910403 (2016). doi: 10.1155/2016/5910403.
29. Tsuruta, L.R., Lopes dos Santos, M., and Moro, A.M., Biotechnol Prog. 31, 1139-1149 (2015). doi: 10.1002/btpr.2066.
30 Kálmán-Szekeres, Z., Olajos, M., and Ganzler, K., J. Pharm. Biomed. Anal. 69, 185-195 (2012). doi: 10.1016/j.jpba.2012.04.037.
31 Berkowitz, S.A., Engen, J.R., Mazzeo, J.R., and Jones, G.B., Nat. Rev. Drug Discov. 11, 527-540 (2012). doi: 10.1038/nrd3746.
32.http://www.fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/Drugs/ArthritisAdvisoryCommittee/UCM510493.pdf
33.http://www.fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/Drugs/ArthritisAdvisoryCommittee/UCM484860.pdf
34. Jung, S.K., Lee, K. H., Jeon, J. W., et al., MAbs 6, 1163-1177 (2014). doi: 10.4161/mabs.32221.
35.http://www.fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/Drugs/ArthritisAdvisoryCommittee/UCM510293.pdf
36. Liu, J., Eris, T., Li, C., Cao, S., and Kuhns, S., BioDrugs 30, 321-338 (2016). doi: 10.1007/s40259-016-0184-3.
37. Sinha-Datta, U., Khan, S., and Wadgaonkar, D., Biosimilars 5, 83-91 (2015) doi: 10.2147/BS.S85537 https://www.dovepress.com/label-free-interaction-analysis-as-a-tool-to-demonstrate-biosimilarity-peer-reviewed-article-BS
