La estabilidad de proteínas es fundamental en el éxito o el fracaso del desarrollo de un producto biofarmacéutico. La estabilidad de las proteínas es un parámetro importante durante la producción, fabricación, formulación, el almacenamiento a largo plazo, la entrega al paciente y la eficacia. Las proteínas con estabilidad alta probablemente tendrán menos problemas durante el proceso de fabricación, su producción es más rentable y tienen más probabilidades de mantenerse funcionales durante la formulación y el almacenamiento, sin sufrir alteración química o agregación. En el enfoque de "calidad basada en el diseño" (QbD, por sus siglas en inglés) para el desarrollo biofarmacéutico, la caracterización de la estabilidad es parte de una evaluación de la "capacidad de desarrollo" o "capacidad de convertirse en fármaco" de un potencial medicamento candidato, así como durante el desarrollo del proceso y la fabricación. Los datos de estabilidad también se incorporan en la caracterización e identificación de la estructura de orden superior (HOS) empleada para el respaldo de la fabricación, la comparabilidad y la biosimilitud. Se espera que la caracterización de la HOS de proteínas se utilice cada vez más en presentaciones regulatorias para nuevos medicamentos biofarmacéuticos y biosimilares.
Debido a la naturaleza compleja de las proteínas, las herramientas biofísicas son importantes para realizar una caracterización completa de un producto biofarmacéutico. Existe una variedad de herramientas biofísicas que se usan para evaluar la estabilidad de las proteínas, incluidos el (pero no limitado a) dicroísmo circular (CD, por sus siglas en inglés), la dispersión de luz dinámica (DLS, por sus siglas en inglés) y estática (SLS, por sus siglas en inglés), la cromatografía por exclusión de tamaño-dispersión de luz multiangular (SEC-MALS, por sus siglas en inglés), la espectroscopía infrarroja transformada de Fourier (FTIR, por sus siglas en inglés), la ultrafiltración de análisis (AUC, por sus siglas en inglés), cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), fluorescencia de barrido diferencial (DSF, por sus siglas en inglés), fluorescencia intrínseca (IF, por sus siglas en inglés) y calorimetría de barrido diferencial (DSC, por sus siglas en inglés).
Si bien todos estos ensayos biofísicos desempeñan un papel importante en el desarrollo biofarmacéutico, la caracterización de la estabilidad térmica por medio de la DSC es fundamental. En un artículo publicado en 2015 sobre las técnicas biofísicas utilizadas para la caracterización de estructuras de orden superior de anticuerpos monoclonales, Gokarn et al. afirmaron: "la DSC sigue siendo una técnica inigualable para evaluar la estabilidad termodinámica de proteínas en una condición de solución amortiguadora determinada"[1].
Este artículo se enfoca en el uso de la DSC para caracterizar la estabilidad térmica de los productos biofarmacéuticos con base proteica (principalmente anticuerpos) y como una herramienta de caracterización de HOS para la comparabilidad de productos biofarmacéuticos (comparación lote con lote, efecto de los cambios en el proceso, etc.), y para el desarrollo de productos biosimilares.
La DSC es una técnica de microcalorimetría que se emplea para caracterizar la estabilidad térmica y conformacional de proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y otros biopolímeros[2-7]. La DSC mide la capacidad térmica en función de la temperatura. Los instrumentos de DSC usados para la caracterización de proteínas descritos en este artículo son instrumentos de "compensación de energía", con un biopolímero en solución ubicado en una celda para muestras fija y una celda de referencia compatible llenada con una solución amortiguadora. La señal de capacidad térmica (Cp) de una celda para muestras se compara con la de una celda de referencia. A medida que aumenta la temperatura de las celdas, la diferencia de temperatura entre la celda de referencia y la celda para muestras se miden y calibran continuamente respecto de las unidades de energía. La DSC es un ensayo de "degradación forzada": a medida que la proteína se expone a una temperatura en aumento, comienza a desplegarse y aumenta la Cp de la proteína (Figura 1).
Figure 1: Cómo funciona la DSC La capacidad térmica (Cp) cambia a medida que la proteína se desnaturaliza térmicamente. El experimento de DSC comienza con una temperatura a la cual la proteína está inicialmente plegada en su conformación nativa. Con el aumento de la temperatura, en algún punto la proteína comenzará a desplegarse o desnaturalizarse (Tde inicio) y la Cp aumenta. En la temperatura a la cual el 50 % de la proteína está en su conformación nativa y el otro 50 % está desnaturalizado, la Cp alcanzará su valor máximo. Este valor es el punto medio de transición térmica o TM. Por sobre el TM, la proteína estará mayormente desnaturalizada y, al final del experimento de DSC, toda la proteína estará en su conformación desplegada. Los parámetros experimentales para la DSC incluyen la Tde inicio, el TM y la entalpía de despliegue (ΔH).
La DSC mide directamente el cambio de la capacidad térmica, sin necesidad de usar fluorescencia o cualquier otro marcador o sonda. Para una proteína que se desnaturaliza de forma reversible, el punto medio de transición térmica (TM), también llamado temperatura de fusión o desnaturalización, es la temperatura a la cual la proteína se encuentra con el 50 % en su conformación nativa (plegada) y el otro 50 % en su conformación desnaturalizada. El TM se observa como el "pico" en un termograma de DSC.
El TM se considera un buen indicador de la estabilidad térmica: mientras más alto el TM, más térmicamente estable es la proteína. Generalmente, las proteínas multidominio (como los anticuerpos) tienen más de un pico en un termograma de DSC, de modo que se puede determinar más de un TM (consulte la Figura 2).
Figura 2: Termograma de DSC representativo de un anticuerpo monoclonal con dominios identificados de CH2, fragmento de unión a los antígenos (Fab, por sus siglas en inglés) y CH3 Las líneas rojas discontinuas son picos deconvolucionados de cada transición de dominio con los tres TM indicados.
La DSC proporciona otros parámetros útiles que se pueden emplear para caracterizar y calificar la estabilidad de las proteínas, incluida la entalpía de despliegue (ΔH), que se mide por el área bajo la curva. El despliegue de proteínas es un proceso endotérmico, ya que se necesita aplicar energía para romper los enlaces secundarios no covalentes que mantienen a la proteína correctamente plegada. La DSC también determina la Tde inicio (comienzo del despliegue), la ΔCp (cambio de la capacidad térmica de despliegue) y la T1/2 (ancho en la mitad de la altura del pico, muestra de la forma del termograma de despliegue). El análisis de DSC puede incluir la determinación de cualquier combinación de estos parámetros.
La mayoría de las proteínas se desnaturalizan de manera irreversible y tienden a agregarse o precipitar luego de la desnaturalización térmica. El TM y otros parámetros derivados del análisis de DSC de proteínas con desnaturalización irreversible no son parámetros termodinámicos verdaderos. Sin embargo, la clasificación del TM de la DSC de la desnaturalización de una proteína irreversible sigue siendo muy útil para las pruebas de estabilidad de parámetros cualitativos.
Malvern Instruments ofrece el sistema MicroCal VP-Capillary DSC[8,9], que corresponde a una DSC automatizada, diseñada para la detección de TM y la caracterización termodinámica de proteínas y biopolímeros en solución.
Figura 3: esquema general de los procesos en el descubrimiento y desarrollo biofarmacéutico
La Figura 3 muestra un esquema generalizado de los procesos de descubrimiento biofarmacéutico y de desarrollo. Las secciones en verde son los puntos en los cuales se utiliza de manera más habitual la caracterización biofísica, incluido el ensayo de estabilidad (al final de este documento hay una lista de "lecturas sugeridas" sobre el descubrimiento y el desarrollo biofarmacéutico).
En el desarrollo de un producto biofarmacéutico apropiado, los científicos primero buscan biomoléculas que ya muestren una alta estabilidad durante la selección de candidatos y puede que sea necesario incluir un aumento de estabilidad por medio de la ingeniería de proteínas. Durante la purificación, la proteína habitualmente se aísla de condiciones donde está estable, correctamente plegada y activa, por lo que es muy importante usar las soluciones amortiguadoras, aditivos, purificación y las condiciones de almacenamiento apropiados para mantener la proteína lo más estable posible a lo largo de este proceso.
Los medicamentos subcutáneos (SC) formulados deben ser estables y no se deben ver afectados con altas concentraciones de proteínas (a veces sobre 100 mg/mL) dentro de los cierres de su contenedor (por ejemplo, ampollas o jeringa llenada previamente) por varios años. Cuando las moléculas de proteína están expuestas a agentes de estrés como el calor, químicos, cambios de pH, presión, mezcla y alta concentración, que con frecuencia pueden ocurrir durante la formulación y la producción biofarmacéutica, la conformación de la proteína puede favorecer la forma desnaturalizada (desplegada). Las proteínas en solución también son susceptibles a modificaciones como la desamidación y la oxidación, que pueden también generar proteínas desnaturalizadas e inactivas. En el caso de los productos biofarmacéuticos de base proteica, la desnaturalización u otras modificaciones podrían generar la formación de agregados que tienen una eficacia reducida o no son funcionales como medicamentos. Y más importante, la agregación de proteínas puede generar una reacción inmunogénica potencialmente fatal en un paciente. Con una proteína estable como la base de un producto biofarmacéutico, se puede generar una producción más rentable y un medicamento exitoso, efectivo y seguro.
La secuencia de aminoácidos o estructura primaria (1°) de una proteína es el componente más básico de la cadena polipeptídica y la estructura de la proteína. Más allá de esto, es importante conocer y caracterizar la estructura tridimensional de la proteína, también llamada estructura de orden superior (HOS). Hay tres niveles de HOS de proteína: la estructura secundaria (2°) se refiere a los patrones de plegado locales de la estructura primaria de una proteína, incluidas las hélices alfa, las láminas beta, los giros y los espirales al azar; la estructura terciara (3°) es la estructura tridimensional de una proteína que surge de su espectro de elementos de la estructura secundaria; y la estructura cuaternaria (4°), que describe las estructuras que surgen de la interacción de dos o más cadenas polipeptídicas idénticas o diferentes.
La DSC es una medida de la estabilidad conformacional y los cambios en la estructura terciaria y cuaternaria que ocurren cuando se desnaturaliza una proteína térmicamente. También entrega una indicación de cómo los factores intrínsecos y extrínsecos afectan la estabilidad de una proteína. La DSC se considera el análisis de mejor calidad y el más cuantitativo para la caracterización de la estabilidad térmica de proteínas biofarmacéuticas y se utiliza para predecir la estabilidad a largo plazo[1,10-14]. El TM de la DSC es un parámetro usado habitualmente para calificar la estabilidad en la selección de candidatos (capacidad de desarrollo), la prueba de formulaciones y el desarrollo del proceso, con más proteínas estables con un TM más alto. La entalpía (∆H), la Tde inicio, la T1/2 y la ∆Cp obtenido con DSC se usan para ordenar la estabilidad, la validación de los datos de DSC, el análisis cuantitativo del despliegue de proteínas y la identificación de estructuras de orden superior[10-14].
El análisis de DSC de una proteína en condiciones de solución definidas es cuantitativo y reproducible si la proteína es la misma o altamente similar (Figura 4). Es decir, los termogramas de DSC tendrán un patrón reproducible y los parámetros (incluidos los TM, la ΔH y la Tde inicio) estarán dentro de un rango aceptado[12-14]. Si los termogramas comparados son diferentes y cambian los parámetros de ajuste de la DSC, esto sugiere que ha ocurrido un evento como el despliegue, degradación o agregación de proteínas, cambios en el solvente, modificación postraduccional u otro cambio en la estructura de orden superior, que afectan la estabilidad conformacional.
Los datos reproducibles y cuantitativos hacen de la DSC un ensayo clave en el análisis de comparabilidad y de HOS para la evaluación de productos durante la fabricación (incluidas la comparabilidad lote con lote y sitio con sitio), la comparación de las variantes de proteínas y productos modificados (incluidos los cambios estructurales producidos por glicosilación y oxidación) y biosimilitud. Los datos de DSC también se usan en documentos regulatorios de respaldo como una caracterización de HOS para nuevas presentaciones de medicamentos y productos biosimilares. En una encuesta realizada a científicos del área biofarmacéutica, la DSC fue calificada como una herramienta de análisis biofísico de HOS "muy útil" a "extremadamente útil" para la selección de candidatos, el desarrollo de formulaciones, la caracterización del producto, la comparabilidad, el desarrollo de procesos y la biosimilitud[15].
Figura 4: 19 termogramas de DSC de albúmina sérica bovina (Sigma A1933, purificado por cromatografía) en un tampón fosfato salino (PBS, por sus siglas en inglés) Datos de DSC que se muestran luego de la normalización de la tasa de barrido, la sustracción buffer-buffer y la sustracción de la línea de base de integración Se muestran las desviaciones media y estándar de la Tde inicio, el TM1 y el TM2.
Para las proteínas multidominio como los anticuerpos, los termogramas de DSC muestran más de una transición de despliegue (como se ve en la Figura 2). Con la DSC se pueden caracterizar y cuantificar los diferentes dominios y se pueden determinar los TM para cada transición. Los valores de TM están representados por los picos del termograma y se pueden determinar de manera muy sencilla a partir de los datos de DSC, sin necesidad de realizar un análisis de datos complejo. Los ensayos biofísicos alternativos que pueden determinar el TM, como el CD, la IF y la DSF, pueden detectar solo el primer TM (que ocurre a la temperatura más baja), o el TM "más dominante" para proteínas multidominio. La extracción de más de un TM de datos espectroscópicos o por fluorescencia requiere del ajuste de datos complejos y es posible que no sea reproducible.
La DSC requiere generalmente más muestra de proteína por barrido y puede presentar un menor desempeño en comparación con otros ensayos de pruebas de TM. Si la muestra es limitada, una buena solución sería realizar un orden inicial del TM, ya sea con DSF o IF, y luego seleccionar varias muestras para validar el TM usando DSC. Es importante validar los resultados de TM con DSC y no solamente basarse en la fluorescencia o espectroscopía para el cálculo del TM para evaluar la estabilidad. En los ensayos basados en fluorescencia, es común ver errores que interfieren en el resultado y es posible que los resultados de TM parezcan cambiar a un valor mayor (o menor) a causa de estos errores. Algunas proteínas y condiciones de solución amortiguadora no son compatibles con la fluorescencia, lo que puede hacer que los cálculos de las diferencias de TM sean muy complicados. Por último, la fluorescencia y la espectroscopía no son capaces de determinar la entalpía calorimétrica y otros parámetros termodinámicos, mientras que la DSC puede entregar toda esta información como un "conjunto de datos" de estabilidad térmica.
En la industria biofarmacéutica, la DSC se considera el ensayo de estabilidad térmica con estándar de referencia, ya que la técnica:
Mide los cambios de calor asociados al despliegue de la proteína.
Es una medición directa del despliegue de una proteína, de modo que no se necesitan marcadores, sondas ni etiquetas. Esto significa que no hay errores potenciales en la detección, que son comunes en la fluorescencia u otros ensayos espectroscópicos.
Mide proteínas nativas en solución y se puede emplear con prácticamente todas las soluciones amortiguadoras y aditivos que se usan habitualmente dentro de la purificación biofarmacéutica y el desarrollo de formulaciones. Algunas de estas soluciones amortiguadoras y aditivos no son compatibles con la fluorescencia o la espectroscopía.
Es fácil de usar para la configuración experimental.
Tiene un control de temperatura de alta precisión y cuenta con un rango de temperatura de operación de hasta 130 °C, de manera que puede detectar la mayoría de las transiciones de TM alto. Otros ensayos de prueba de TM pueden calentar las muestras solo hasta 100 °C (o menos).
Es un ensayo de "degradación forzada", por lo que no requiere el almacenamiento de la proteína en soluciones amortiguadoras antes del análisis. La cromatografía por exclusión de tamaño (SEC-HPLC, por sus siglas en inglés) y la DLS habitualmente necesitan la incubación de muestras en una solución amortiguadora a temperaturas elevadas para detectar cambios en la conformación.
Entrega datos de manera simple y cuenta con un software de análisis de datos integrado.
Se puede utilizar para resolver transiciones de despliegue por separado y caracterizar proteínas multidominio y proteínas complejas, así como proteínas simples de un dominio.
Proporciona una gran cantidad de información: entrega información termodinámica, además de la estabilidad conformacional y la determinación del TM.
Se puede utilizar como un ensayo primario para la caracterización de la estabilidad térmica bioterapéutica y también se puede usar con otras herramientas de prueba biofísicas que son ortogonales/complementarias o validan otros datos.
Está disponible con automatización de alto rendimiento (sistema MicroCal VP-Capillary DSC) para la detección rápida de la estabilidad térmica.
Comparabilidad biofarmacéutica
Los anticuerpos monoclonales y otros medicamentos biofarmacéuticos son proteínas complejas expresadas en células de mamíferos o de bacterias. Cada proteína es única y requiere de un estudio exhaustivo, caracterización y optimización para transformarla en un medicamento. Como parte del descubrimiento y desarrollo temprano, se definen las propiedades deseadas del medicamento con base proteica, incluida la pureza, la potencia y la dosificación. Los ensayos bioquímicos, biofísicos y biológicos se desarrollan para estudiar estas características y se optimizan en todo el desarrollo del producto.
La caracterización detallada de proteínas y la HOS (incluida la estabilidad) se realiza para cada proceso con el fin de definir los atributos de calidad principales de la proteína y los parámetros fundamentales del proceso, que son necesarios para controlar y validar los procesos durante todo el ciclo de vida del producto. En el enfoque de "calidad basada en el diseño" (QbD, por sus siglas en inglés) para el desarrollo biofarmacéutico, los atributos de calidad principales y la caracterización de la estabilidad son parte de la evaluación del medicamento durante el desarrollo del proceso y el respaldo de la fabricación[16,17].
Durante el procesamiento de un medicamento con base proteica, la proteína se expone a diferentes condiciones, donde se incluyen:
Diferentes soluciones, incluso diversas soluciones amortiguadoras, pH, y sales
Aditivos de formulación (excipientes)
Gama de concentraciones de proteínas
Ciclos repetidos de congelamiento y descongelamiento, aumento de presión y mezcla/agitación
Diferentes superficies de material con las que entra en contacto la proteína (bombas, membranas de ultrafiltración/diafiltración, medios de cromatografía, etc.)
Exposición a oxidantes, proteasas, medios de crecimiento de células, variantes de productos, etc.
Cualquiera de estas condiciones puede alterar las fuerzas y las interacciones que mantienen a la proteína en su conformación plegada nativa, lo que da como resultado una proteína desnaturalizada o inactiva. Se puede producir desnaturalización química a causa de oxidación, desamidación, cambios en la glicosilación u otras modificaciones postraduccionales.
Las proteínas desnaturalizadas habitualmente forman agregados, que son un problema clave para el desarrollo biofarmacéutico. Los agregados se asocian a estados de monómeros de proteínas y la formación de agregados puede ser reversible o irreversible, cuyo tamaño puede ir desde dímeros de proteínas a partículas grandes que son visibles al ojo humano. Como mínimo, la agregación de proteínas reduce la eficacia y la potencia del medicamento, y aumentará el costo de la producción. El mayor problema de los agregados de proteínas y partículas es su potencial para aumentar la presencia de reacciones inmunogénicas, lo que, en casos extremos, pueden causar la muerte del paciente. Debido a este problema, la agregación de proteínas se ha examinado en gran medida dentro de la industria biofarmacéutica. Esto incluye la detección, cuantificación y caracterización de partículas/agregación durante la producción y la formulación, y la búsqueda de soluciones para reducir o eliminar la agregación de proteínas en productos biofarmacéuticos.
Es importante demostrar que los medicamentos con base proteica fabricados, en los ensayos de estructura, estabilidad, distribución de tamaño, bioquímicos y funcionales, son similares a:
La misma proteína fabricada en lotes previos y también el lote de la proteína de referencia
La misma proteína fabricada en diferentes instalaciones
La misma proteína fabricada usando un proceso de elaboración o transformación modificado
El aumento del proceso de elaboración o transformación
La misma proteína en la misma solución
Los ensayos bioquímicos, biofísicos, de HOS y funcionales para la comparabilidad (o biocomparabilidad) están diseñados para demostrar que el producto con base proteica fabricado es "altamente similar" en los atributos de calidad principales designados, en comparación con una proteína de referencia. Es esencial que la HOS de los candidatos para medicamentos con base proteica se analice de manera cuidadosa en cada etapa del desarrollo.
Los cambios en el proceso de fabricación de un producto biofarmacéutico pueden ocurrir durante el desarrollo del proceso y luego de la aprobación del medicamento. Las razones de tales cambios incluyen:
Mejora del proceso de fabricación (por ejemplo, rendimiento del producto, costo reducido)
Incremento en la escala
Un cambio de instalación de fabricación
Cambios regulatorios y de cumplimiento
Mejora de la estabilidad del producto
Cuando se realizan cambios significativos en el proceso de fabricación, se debe realizar un ejercicio de comparabilidad para evaluar el impacto de los cambios en los atributos de calidad principales, la seguridad y la eficacia del producto biofarmacéutico. La demostración de la comparabilidad no necesariamente significa que los atributos de calidad principales del producto previo y posterior al cambio sin idénticos, sino que son altamente similares. Los cambios en la fabricación no deben tener un impacto negativo en la calidad del producto.
La comparabilidad es la mayor preocupación para los productos terapéuticos con base proteica y se aborda en varias agencias regulatorias internacionales [18,19,20]. No se puede usar ningún método de análisis para la evaluación de comparabilidad de medicamentos con base proteica. Los estudios de HOS y comparabilidad incluyen (pero no se limitan a): DSC, DLS, fluorescencia, CD, AUC, SEC, espectroscopía Raman, análisis de rastreo de nanopartículas (Nanosight de Malvern Instruments), medición de masa resonante (Archimedes de Malvern Instruments) y microscopía. La bioactividad y la eficacia de la proteína también se monitorean usando ensayos biológicos, calorimetría de titulación isotérmica (ITC, por sus siglas en inglés) y resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en inglés).
La información proporcionada por cada método biofísico es específica y, cuando se evalúan en conjunto, entregan información estructural para la caracterización de HOS y la comparabilidad. El mapa de HOS ayuda a garantizar la consistencia en la estructura de proteínas en el aumento durante el ciclo de desarrollo del proceso, la comparabilidad lote con lote cuando los procesos se transfieren a nuevas instalaciones de fabricación y cuando se modifica la producción. La información de la caracterización de HOS también es muy importante para la evaluación de productos biosimilares.
Es importante considerar que las pruebas y el establecimiento de la comparabilidad durante el proceso de fabricación (o cambio) no son lo mismo que las pruebas realizadas durante el desarrollo de un medicamento biosimilar. El desarrollo de productos biosimilares es un proceso mucho más complejo. Dado que los productos biosimilares habitualmente no son producidos por la misma empresa que desarrolló el producto original (también llamado producto "parental" [original] o de referencia), el desarrollo de productos biosimilares requiere una "ingeniería inversa" para establecer los nuevos procesos de elaboración y transformación. El fabricante del producto biosimilar debe igualar la calidad del producto (biosimilitud) dentro del estrecho rango del producto comercial del componente original, lo que requiere más evidencia biofísica y bioquímica para demostrar la biosimilitud en comparación con lo que se necesita habitualmente para mostrar la comparabilidad durante la fabricación.
Dado que la DSC entrega información sobre la estabilidad térmica de una proteína en diferentes condiciones de solventes y, debido a que los resultados de la DSC son reproducibles (Figura 4), la DSC frecuentemente se incluye en estudios de comparabilidad para mostrar que los procesos no generan cambios en la estabilidad del producto y que los productos fabricados sacados de diferentes lotes o instalaciones de fabricación son altamente similares.
Jiang y Nahri[21] examinaron varias técnicas biofísicas para la comparabilidad durante el desarrollo del proceso y la fabricación. Citaron el uso de DSC como una de las herramientas de caracterización biofísica empleadas en la comparabilidad de un medicamento de anticuerpos monoclonales expresados por líneas celulares diferentes (líneas celulares 1 y 2), que también experimentaron un cambio en el proceso de producción (procesos 2pA y 2pB). Los tres productos con base proteica resultantes se evaluaron con FTIR (para determinar la estructura secundaria), CD UV cercano y fluorescencia intrínseca (para comparar la estructura terciaria), fluorescencia y enlace de ANS (para comprar la hidrofobicidad de la superficie), DLS (para comparar la distribución de las proteínas) y DSC (para comparar la estabilidad y la solubilidad térmicas).
Los resultados de este conjunto de ensayos biofísicos sugirieron que las estructuras generales secundarias y terciarias de las tres muestras eran similares. Los resultados de la DSC indicaron que la estabilidad térmica de la proteína desde la línea celular 2pB aumentó significativamente en comparación con la muestra 2pA y la muestra de la línea celular 1. Las muestras de 2pA y la línea celular 1 también parecían ser más heterogéneas, de acuerdo con la DSC. Normalmente, se observaron 2 a 3 transiciones para los anticuerpos (consultar Figura 2 para ver un ejemplo de un termograma de DSC típico de un anticuerpo). La presencia de un número mayor de transiciones térmicas superpuestas, de acuerdo con el análisis de DSC de estas muestras, indicó la heterogeneidad de las muestras. Los resultados de DSC sugirieron que el cambio del proceso mejoró la homogeneidad y la estabilidad del anticuerpo monoclonal de interés. En función de los datos de comparabilidad de ensayos biofísicos, bioquímicos y funcionales discutidos en el artículo, se consideró que la línea celular 2 y el proceso 2pB producían la proteína más estable[21].
En un segundo ejemplo de Jiang y Nahri[21], se empleó DSC para observar la comparabilidad de un producto con base proteica producido en diferentes instalaciones de fabricación. La proteína Y comprendía dos cadenas polipeptídicas monoméricas, con enlace disulfuro a través de la región de fragmentos cristalizables (Fc, por sus siglas en inglés) de la molécula. Durante el curso de su desarrollo, la proteína Y se fabricó en diferentes instalaciones. Para verificar que la proteína presente en estos lotes diferentes era similar en su conformación nativa, estructuras secundarias y terciaras, estabilidad térmica y la distribución de tamaño en cuatro muestras diferentes de proteína Y, que representan tres muestras fabricadas en diferentes instalaciones y el estándar de la proteína de referencia, se analizaron con FTIR, CD UV lejano, CD UV cercano, fluorescencia, DSC y AUC.
Los barridos de DSC con estándar de referencia y 3 muestras de diferentes instalaciones de fabricación mostraron dos transiciones térmicas para cada muestra, y los cuatro perfiles de DSC fueron idénticos dentro de la variabilidad experimental. Esto sugiere que no hubo ninguna diferencia en la estabilidad térmica de las muestras de proteína y que todas estaban plegadas en la conformación nativa. Los resultados de caracterización biofísica combinados, incluidos aquellos producidos con DSC, demostraron que las cuatro muestras de proteína Y fueron similares, que tuvieron la estructura secundaria y terciaria apropiada y que eran homogéneas[21].
Si los termogramas de DSC no hubieran sido idénticos, esto puede haber indicado un cambio en la modificación postraduccional o que ocurrió una desnaturalización química en la proteína relacionada con el proceso o la formulación. Arthur et al.[22] demostraron la sensibilidad de la DSC en la detección de cambios de HOS en la estabilidad a causa de la oxidación, que es una forma de degradación química común. Si un producto biofarmacéutico se somete a oxidación durante la purificación o el almacenamiento en la formulación final, esto puede impactar de forma negativa en la eficacia y puede aumentar la probabilidad de formación de agregación de proteínas. En este estudio, los productos con base proteica de tres clases estructurales se evaluaron en múltiples niveles de oxidación. Cada proteína mostró una disminución lineal en el TM en función de la oxidación de metionina. Los autores también observaron diferencias en la velocidad de cambio en el TM, así como diferencias en la estabilidad del TM del dominio, en todas las clases estructurales y dentro de ellas[22]. En contraste, el CD UV cercano y la espectroscopía de fluorescencia fueron mucho menos sensibles a los cambios conformacionales inducidos por oxidación. La DSC es un método de caracterización estructural más apropiado para monitorear la oxidación de una proteína, en comparación con estos métodos espectroscópicos[22]. Para una proteína en el estudio (IgG2B), los cambios en el TM se detectaron por medio de DSC antes de una pérdida de potencia relativa, lo que demuestra que la DSC es un indicador de primer orden de la disminución de los enlaces de antígenos. Los cambios detectables en la metionina oxidada por medio espectrometría de masa (MS, por sus siglas en inglés) ocurrieron en los niveles de oxidación inferiores a aquellos con impacto conformacional y funcional detectable. Con el uso de cambios de TM de DSC junto con MS y métodos de potencia, la relación entre una modificación estructural primaria, los cambios en la estabilidad de HOS y conformacional y el impacto funcional se pueden caracterizar de manera confiable.
Morar-Mitrica et al.[12] describen varios estudios de caso que incorporan DSC en estudios de HOS y comparabilidad de medicamentos biofarmacéuticos, incluidos la caracterización de la oxidación de anticuerpos monoclonales por medio de cambios de TM observables (similares a los descritos en [22]), perfiles de termograma de DSC reproducibles y el uso de TM, T1/2, Tde inicio y ∆H para estudios de comparabilidad de productos biofarmacéuticos, y la caracterización extendida de los anticuerpos monoclonales glicosilados con diferentes niveles de glicosilación (una modificación postraduccional común).
Shahrokl et al.[23] analizan el grado de utilidad de la DSC en estudios de comparabilidad como parte de la aplicación de licencias biológicas y mencionan la facilidad de uso de la DSC y la simpleza de los datos que proporciona. Los autores describen cómo se utiliza la DSC para la comparabilidad de una glicoproteína de 51 kDA antes y después de un cambio en el proceso de fabricación. El cambio de proceso se implementó para aumentar el rendimiento del producto, así como para eliminar los materiales derivados de animales que se originan en el medio de cultivo celular. Con la DSC, los autores evaluaron tres lotes de glicoproteína producidos con cada proceso de fabricación. Observaron que los termogramas de DSC eran equivalentes y mostraron una sola transición a 60,7 °C +/- 0,1 °C. Los resultados de la DSC mostraron que el cambio en la fabricación no afectó la estabilidad conformacional de la glicoproteína[23].
Lubiniecki et al.[24] evaluaron el impacto de los cambios de fabricación en la estructura y la función de anticuerpos durante el curso del desarrollo del producto por medio de la realización de tres estudios de comparabilidad para dos candidatos de anticuerpos monoclonales IgG1 diferentes (anticuerpo A y anticuerpo B). Dos de los estudios de comparabilidad incorporaron la DSC como una de las herramientas de análisis biofísico y bioquímico. Uno de los estudios observó el aumento del proceso y la transferencia a la instalación de fabricación, junto con el cambio de una forma liofilizada a una dosificación líquida. Los termogramas de DSC para formulaciones liofilizadas y líquidas para los anticuerpos A y B mostraron una buena correlación[24]. La DSC, utilizada junto con MS, CD, SEC y otros ensayos, mostró que el cambio en la fabricación no afectó la estructura ni la función de los anticuerpos.
El tercer estudio de comparabilidad evaluó la formulación líquida del anticuerpo en jeringas llenadas previamente o ampollas[24]. Los resultados de la DSC, CD, SEC y otros ensayos sugirieron una estructura molecular, actividad biológica y perfiles de degradación similares. La única excepción notoria fue un pequeño aumento (pero significativo) en los niveles de partículas subvisibles en las jeringas llenadas previamente[24].
Un producto biosimilar (también llamado "producto biológico de seguimiento" o "producto de entrada posterior") es un producto biofarmacéutico que ha sido aprobado por una agencia regulatoria en función de su alta similitud con un producto biológico previamente aprobado, llamado "producto de referencia" (también conocido como producto innovador). Los productos biosimilares han estado disponibles a nivel global por varios años[25-29]. Cuando se escribió este documento (octubre de 2016), la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) había aprobado cuatro medicamentos biosimilares y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) aprobó 19 medicamento biosimilares.
Tenga en cuenta que desarrollar un producto biosimilar no es lo mismo que desarrollar un medicamento genérico de pequeñas moléculas. Los medicamentos de pequeñas moléculas son químicos y la síntesis de estos medicamentos es un proceso controlado. Dado que los medicamentos biofarmacéuticos son normalmente proteínas hay un cierto grado de variación de las proteínas, incluso entre los diferentes lotes del mismo producto, debido a la variabilidad inherente del sistema de expresión biológica y el proceso de fabricación. Estas variaciones pueden incluir diferencias en la modificación postraduccional y la HOS. Los productos biosimilares no son fáciles de producir como genéricos debido al peso molecular alto, a las estructuras complejas y a las variaciones naturales de las proteínas. Un producto biosimilar no es un duplicado exacto del producto de referencia y, por esta razón, normalmente se caracteriza como "similar" o "altamente similar" al producto de referencia.
El desarrollo de un producto biosimilar involucra comparaciones fisicoquímicas, analíticas y funcionales de la proteína de referencia y el producto biosimilar. Estos ensayos se complementan con datos comparativos no clínicos y clínicos para establecer la eficacia y seguridad equivalentes. Antes de su aprobación, se debe verificar que el producto biosimilar no tiene diferencias clínicamente significativas en términos de seguridad y efectividad con el producto de referencia. En productos biosimilares se permiten solo diferencias menores en componentes clínicamente inactivos. Se espera que el producto biosimilar funcione de la misma manera en que lo hace el producto de referencia para las mismas indicaciones aprobadas.
Las agencias reguladoras evalúan los productos biosimilares en función de su nivel de similitud con sus productos de referencia. Debido a la complejidad de los productos biofarmacéuticos, no es probable que dos fabricantes diferentes produzcan dos productos idénticos, incluso si se usan sistemas huésped de expresión, procesos y tecnologías equivalentes. Por lo tanto, los productores de medicamentos biosimilares necesitan confiar en estudios y análisis de comparabilidad de HOS, como se indica más arriba[30,31]. La necesidad de incrementar la información analítica y la pretensión de tener plazos reducidos en el desarrollo de productos biosimilares exige la demostración de comparabilidad con la molécula de referencia en todas las etapas, particularmente durante la fabricación.
Los productos biosimilares deben ser diseñados en reversa para que coincidan con el producto de referencia en el mayor grado posible. La caracterización analítica de un producto biosimilar incluye la evaluación de la estructura primaria y de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), la actividad biológica y el análisis de las impurezas del proceso y del producto. La DSC se usa comúnmente como un ensayo biofísico de HOS para demostrar que un producto biosimilar tiene una naturaleza de la huella molecular del perfil de DSC altamente similar y un TM, una Tde inicio y otros parámetros termodinámicos muy similares en comparación con el producto de referencia.
Tres de los cuatro productos biosimilares aprobados por la FDA de los EE.UU. (octubre de 2016) incluyeron la DSC como uno de los ensayos de HOS en la presentación para la FDA:
Erelzi (de Sandoz, Inc.) es un producto biosimilar de Enbrel de Amgen (etanercept)[32] .
Inflectra (de Celltrion), llamado Remsina en otros mercados, es un producto biosimilar de Remicade de Janssen (infliximab) [33,34].
Amjevita (de Amgen) es un producto biosimilar de Humira de Abbvie (adalimumab)[35,36].
Sinha-Datta et al.[37] demostraron el uso de DSC (MicroCal VP-Capillary DSC) y la resonancia de plasmón superficial (SPR) como herramientas analíticas para comparar dos anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAb1-i y mAb2-i) con sus biosimilares (mAb1-B y mAb2-B1, B2, B3) en función de la estabilidad térmica, la cinética y la afinidad. Observaron que los productos biosimilares eran muy similares a sus muestras de referencia respecto de la función biológica obtenida de los resultados de SPR. La DSC se usó como otra confirmación de biosimilitud entre los productos originales y los biosimilares. El análisis de DSC mostró una buena similitud estructural para los anticuerpos originales y biosimilares, con el TM primario a 84,1 °C (para el mAb1) y 72,8 °C (para el mAb2).
La información presentada en este documento demuestra la importancia y el valor de la incorporación de la DSC como un ensayo de estabilidad biofísica y HOS para la comparabilidad biofarmacéutica y la caracterización de la biosimilitud. Con los resultados de DSC, junto con los de otros ensayos bioquímicos y biofísicos, las empresas biofarmacéuticas pueden tomar decisiones informadas sobre la estabilidad y comparabilidad de proteínas durante la producción, pueden garantizar que cada lote de proteínas es muy similar al lote de referencia, y que cualquier cambio en el proceso o la fabricación no afecta la estabilidad conformacional de la proteína. La DSC se incluye también como un ensayo de HOS para el desarrollo de productos biosimilares con el fin de ayudar a demostrar que el producto biosimilar es "altamente similar" al original.
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